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1. Acoplamento de Nanopartículas Magnéticas (MNPs)
- Use o procedimento de acoplamento comercial e reagentes para acoplar MNPs com anticorpos (Abs) (normalmente 1 mg). Nanopartículas de óxido de ferro com ácido carboxílico como grupos reativos são usadas.
- Se os anticorpos estiverem em um volume superior a 0,5 ml, concentre-se usando um concentrador de 100K. Gire a 2.000 x g por 3-5 min.
- No final do procedimento, após adicionar 10 μl do tampão de têmpera, transferir MNPs para um tubo de 12 mm x 75 mm e adicionar 3 ml de tampão de lavagem/armazenamento. Coloque o tubo no orifício central de um separador magnético e deixe durante a noite a 4 °C.
- Verifique se os MNPs foram todos coletados na lateral do tubo e, em seguida, pipete cuidadosamente todo o líquido. Adicione 3 ml de tampão de lavagem/armazenamento fresco e coloque de volta no ímã.
- Após várias horas, verifique se os MNPs são coletados na lateral do tubo e, em seguida, pipete o líquido. Utilizar 2 ml de tampão de lavagem/armazenamento para ressuspender os MNP e conservar a 4 °C.
- Verifique se os Abs estão acoplados a MNPs marcando-os com um fragmento de anticorpo Fab fluorescente relevante (por exemplo, anti-camundongo de cabra se estiver usando um Ab monoclonal de camundongo para captura conforme descrito na seção 2) e execute em um citômetro de fluxo.
2. Marcação de anticorpos acoplados a MNPs
- Combine 60 μl (3,9 x 1012 partículas) de MNPs (por condição) e 5 μl (de uma solução comercial de 200 μg / ml) fragmentos Fab marcados, específicos para o isotipo da captura Ab em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Incubar à temperatura ambiente (RT) durante 30 min com mistura contínua.
- Pré-umedeça um concentrador de 100K com 300 μl de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e gire em uma microcentrífuga a 1.500 x g por 5 min.
- Purifique complexos marcados na coluna de 100K. Gire a mistura da etapa 2.2 em uma microcentrífuga a 1.500 x g por 5 min, lave com 200 μl de PBS e recupere no volume inicial.
3. Uso de complexos Ab-MNP marcados para capturar partículas de interesse (vesículas extracelulares, EVs)
- Incube MNPs pré-marcados 60 μl (3,9 x 1012 partículas) com preparação EV (100 μl).
- Prepare as preparações EV usando vários métodos. Aqui, purifique EVs em gradientes de sacarose, colete-os do plasma pobre em plaquetas usando reagentes de precipitação de exossomos ou isole diretamente do plasma.
nota: As proporções ideais precisam ser determinadas para cada experimento e dependem da concentração de EV na preparação. A fração MNP-Ab deve ser ~ 106 em excesso em comparação com a concentração da fração EV.
- Incubar 1 hora a 4 °C para VEs.
- Adicione 2,5% de IgG de camundongo / IgG humano para bloquear a ligação Fc, vórtice suavemente, incube 3-5 min em RT.
- Adicione as concentrações recomendadas ou tituladas pelo fabricante de cada Abs de detecção e incube 20 min adicionais em RT.
4. Separação dos EVs capturados por MNP de anticorpos não ligados usando colunas magnéticas
- Prepare a coluna de separação magnética para uso, colocando-a em um ímã separador.
- Umedeça previamente a coluna com 500 μl de tampão de lavagem (ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 2 mM, albumina de soro bovino (BSA) a 0,5% em PBS). Deixe o tampão de lavagem fluir através da coluna.
- Adicione os complexos MNP-EV à coluna e permita que todo o líquido flua. Adicione 500 μl de tampão de lavagem à coluna, permitindo a passagem de todo o volume.
- Repita a lavagem com tampão de lavagem mais 2 vezes.
- Remova a coluna do ímã e coloque em um tubo de 12 mm x 75 mm para coleta dos complexos MNP-EV retidos. Deixe a coluna repousar no tubo fora do ímã por 3 min. Adicione 200 μl de PBS e deixe os grânulos fluírem por gravidade, adicione mais 200 μl de PBS e fixe com 200 μl de paraformaldeído a 4% após a eluição.
nota: O paraformaldeído é suspeito de ser cancerígeno e deve ser manuseado com capuz ventilado e luvas devem ser usadas.
- Para quantificar EVs individuais, use configurações volumétricas no High Throughput Sampler (HTS) ou, pouco antes da aquisição, adicione contas de contagem de citometria de fluxo bem misturadas.
5. Análise de EVs capturados por MNPs com um citômetro de fluxo
- Aqueça o citômetro de fluxo por 30 min.
- Execute contas de controle de qualidade.
- Defina o limite de fluorescência de MNPs ou EVs marcados. Use PBS filtrado de 0,22 μm para limite para diminuir o "ruído" de fundo. Defina o limite ajustando a tensão PMT no nível em que o PBS filtrado não dá nenhum ou muito poucos eventos.
- Execute amostras em baixa. (Use um filtro em linha adicional de 0,04 μm para fluido de bainha colocado em série atrás do filtro de bainha padrão de 0,2 μm para eliminar ainda mais eventos falsos).