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1. Preparação de Amostras Biológicas
NOTA: O local anatômico escolhido e o volume de coleta de sangue são deixados a critério de cada investigador individual e não afetarão o resultado do ensaio. No entanto, uma vez obtidas, as amostras devem ser manuseadas de acordo com as etapas listadas abaixo.
- Preparação de amostras de soro
- Colete o volume desejado de sangue no tubo de coleta preferido e deixe-o coagular por pelo menos 30 minutos.
- Centrifugue a amostra por 10 min a 1.000 x g em temperatura ambiente.
- Remover o soro e dosear imediatamente ou alíquota para tubos de microcentrífuga de polipropileno e armazenar as amostras a ≤ -20 °C.
- Preparação de amostras de plasma
- Colete o volume desejado de sangue usando tubos de coleta de sangue revestidos com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
- Centrifugue por 10 min a 1.000 x g em temperatura ambiente dentro de 30 min após a coleta.
- Remover imediatamente o plasma e dosear ou alíquota para tubos de microcentrífuga de polipropileno e armazenar as amostras a ≤ -20 °C.
- Preparação de amostras sobrenadantes de cultura de tecidos
- Centrifugue a amostra por 10 min a 1.500 x g a 4 °C para remover células e detritos.
- Recolher imediatamente o sobrenadante e dosear para tubos de microcentrífuga de polipropileno e conservar a ≤ -20 °C.
- Descongelamento de Amostras Biológicas Congeladas
- Descongele completamente todas as amostras biológicas previamente congeladas no gelo e no vórtice brevemente antes de usar. Evite mais de 2 ciclos de congelamento/descongelamento.
nota: As amostras utilizadas neste protocolo foram obtidas por cultura de esplenócitos de camundongo BALB/c (1 x 106 células a 37 °C + 5% CO2 sob várias condições: não estimuladas, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 μg/mL revestido em placa) + αCD28 (1 μg/mL solúvel), PMA (20 ng/mL) + Ionomicina (500 ng/mL). Os sobrenadantes da cultura foram coletados após 48 h e processados conforme descrito na seção 1.3.
2. Preparação do reagente
- Preparação de grânulos pré-misturados com anticorpos imobilizados
- Sonicate o frasco de esferas pré-misturadas por 1 min em um banho de sonicador em temperatura ambiente e, em seguida, vórtice por 30 s antes do uso. Se nenhum banho de sonicador estiver disponível, aumente o tempo do vórtice para 1 min.
- Preparação do tampão de lavagem
- Leve o tampão de lavagem 20x (20x PBS com 1% Tween-20) fornecido com o kit à temperatura ambiente e vórtice para trazer todos os sais para a solução.
- Dilua 25 mL de tampão de lavagem 20x com 475 mL de água deionizada. Armazene as porções não utilizadas entre 2 °C e 8 °C por até um mês.
- Preparação da Matriz B (para uso apenas com amostras de soro e plasma)
- Adicione 5,0 mL do tampão de ensaio (PBS com 1% de BSA) incluído no kit ao frasco contendo a matriz B liofilizada. Aguarde pelo menos 15 minutos para a reconstituição completa e, em seguida, misture bem o vórtice. As sobras de Matrix B reconstituídas podem ser armazenadas a ≤ -70 °C por até um mês.
3. Preparação padrão
NOTA: Cada analito neste painel tem uma concentração padrão superior de 10.000 pg/mL.
- Adicione 250 μL de tampão de ensaio para reconstituir o coquetel padrão de citocina de Th de camundongo liofilizado. Misture por vórtice breve e deixe o frasco para injetáveis descansar em temperatura ambiente por 10 min.
- Transfira o coquetel padrão para um tubo de microcentrífuga de polipropileno rotulado como "C7". Isso será usado como o padrão superior.
- Rotule 6 tubos de microcentrífuga de polipropileno como C6, C5, C4, C3, C2 e C1.
- Adicione 75 μL de tampão de ensaio a cada um desses tubos.
- Transfira 25 μL do padrão superior C7 para o tubo C6 e misture bem por vórtice. Este será o padrão C6.
- Continue realizando diluições seriais 1:4 usando uma nova ponta de pipeta para cada tubo para adicionar 25 μL do padrão anterior aos 75 μL de tampão de ensaio no próximo tubo padrão mais baixo, seguido de vórtice para obter os padrões C5, C4, C3, C2 e C1. Use o tampão de ensaio como o padrão de 0 pg/mL (C0).
4. Diluição da amostra
NOTA: Experimentos piloto preliminares usando este ensaio com múltiplas diluições podem ser necessários para determinar o fator de diluição mais apropriado para um determinado conjunto de amostras biológicas. Um fator de diluição adequado produzirá cálculos de concentração para a amostra que se encontram dentro dos limites da curva padrão. As etapas a seguir são diretrizes e podem ter que ser determinadas empiricamente, dependendo do tipo de amostra.
- Dilua amostras de soro ou plasma 2 vezes com tampão de ensaio (por exemplo, dilua 50 μL de amostra com 50 μL de tampão de ensaio) em tubos de microcentrífuga de polipropileno.
nota: Se for necessária uma diluição adicional da amostra, as diluições devem ser feitas com a Matriz B em vez do tampão de ensaio para garantir uma medição precisa. A adição de amostras de soro ou plasma sem diluição resultará em baixa precisão do ensaio e poderá entupir a placa filtrante. A matriz B é composta por soro de camundongo agrupado esgotado de alvos de ensaio endógenos. É usado como diluente de amostra de soro ou plasma para evitar efeitos de matriz, que são conhecidos por afetar a sensibilidade analítica dos imunoensaios.
- Teste amostras sobrenadantes de cultura celular sem diluição.
nota: Os níveis de analito podem variar muito de amostra para amostra. Se necessário, diluir as amostras sobrenadantes utilizando uma nova preparação do seu meio de cultura celular ou tampão de ensaio correspondente.
5. Procedimento de ensaio
NOTA: O ensaio pode ser realizado em placas filtrantes de polipropileno, tubos de classificação de células ativadas por microfluorescência (FACS) ou microplacas de fundo em V. O procedimento de ensaio de placa filtrante é recomendado devido à boa consistência amostra a amostra, robustez do ensaio e facilidade de manuseio. Este procedimento requer uma unidade de filtragem a vácuo para lavagem (fornecida pelo usuário final).
- Deixe todos os reagentes aquecerem à temperatura ambiente (20 - 25 °C) antes de usar.
- Coloque a placa filtrante em uma tampa de placa invertida o tempo todo durante as etapas de configuração e incubação do ensaio para que a parte inferior da placa não toque em nenhuma superfície, pois pode causar vazamentos.
- Mantenha a placa na posição vertical durante todo o procedimento de ensaio, incluindo as etapas de lavagem, para evitar a perda de grânulos.
- Mantenha a placa no escuro ou embrulhada com papel alumínio para todas as etapas de incubação.
- Execute todos os padrões e amostras como duplicatas dispostas na placa em uma ordem sequencial.
- Umedeça previamente a placa filtrante adicionando 100 μL de 1x tampão de lavagem a cada poço e deixe-o descansar por 1 min em temperatura ambiente (se estiver usando microplaca com fundo de filtro).
- Remova o volume do buffer usando o coletor de vácuo (5 - 10 s). Não exceda 10 " Hg de vácuo. Seque o excesso de tampão de lavagem do fundo do prato pressionando o prato em uma pilha de toalhas de papel limpas. Coloque a placa em cima da tampa da placa invertida.
nota: As etapas 5.1 a 5.2 podem ser omitidas se o ensaio for realizado usando uma microplaca de fundo em V ou tubos micro FACS.
- Para amostras sobrenadantes de cultura de células, adicione 25 μL de tampão de ensaio a todos os poços. Adicione 25 μL de cada padrão aos poços padrão. Adicione 25 μL de cada amostra aos poços de amostra.
- Para medir amostras de soro ou plasma, adicione 25 μL de Matriz B aos poços padrão. Adicione 25 μL de tampão de ensaio aos poços de amostra. Adicione 25 μL de cada padrão aos poços padrão. Adicionar 25 μL de cada amostra de soro ou plasma diluído aos alvéolos de amostra.
- Vortex misturou grânulos por 30 s. Adicione 25 μL de grânulos mistos a cada poço, agitando o frasco de grânulos intermitentemente para evitar que o grânulo assente. O volume final deve ser de 75 μL em cada poço após a adição de grânulos.
- Sele a placa com um selador de placas. Enrole todo o prato, incluindo a tampa invertida do prato, com papel alumínio. Coloque a placa em um agitador de pratos, prenda-a e agite a aproximadamente 500 rpm por 2 h em temperatura ambiente. Para evitar vazamentos, não aplique pressão positiva no selador de placas.
- Sem inverter, coloque a placa no coletor de vácuo, aplique vácuo como antes e adicione 200 μL de tampão de lavagem 1x a cada poço.
- Remova o conteúdo dos poços da placa de ensaio por filtração a vácuo. Seque o excesso de tampão de lavagem do fundo do prato com uma almofada absorvente ou toalhas de papel. Repita esta etapa mais uma vez.
nota: Se o ensaio for realizado usando uma microplaca de fundo em V ou tubos micro FACS, pule as etapas 1.12 e 1.13. Em vez disso, centrifugue a placa a 1.000 x g por 5 min em temperatura ambiente e, em seguida, remova o sobrenadante usando uma pipeta multicanal.
- Adicione 25 μL de anticorpos de detecção (consulte a Tabela de Materiais) a cada poço.
- Sele a placa com um selador de placas novo. Enrole todo o prato, incluindo a tampa invertida do prato, com papel alumínio.
- Coloque a placa em um agitador de placas e agite a aproximadamente 500 rpm por 1 h em temperatura ambiente.
- Sem aspirar, adicione 25 μL de reagente estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE) diretamente em cada poço. Não é necessária qualquer diluição do reagente.
- Sele a placa com um selador de placas novo. Enrole todo o prato, incluindo a tampa invertida do prato, com papel alumínio.
- Coloque a placa em um agitador de placas e agite a aproximadamente 500 rpm por 30 min em temperatura ambiente.
- Repita a etapa 1.13 acima.
- Adicione 200 μL de 1x tampão de lavagem a cada poço. Suspenda novamente as contas em um agitador de pratos por 1 min.
- Usando uma pipeta multicanal, transfira amostras da placa filtrante para tubos FACS para ler amostras em um citômetro de fluxo.
nota: O volume da amostra pode ser aumentado de 200 μL para 300 μL adicionando 100 μL extras de 1x tampão de lavagem a cada tubo para evitar que a amostra seque. Se necessário, as amostras podem ser armazenadas a 4 °C, protegidas da luz e analisadas no dia seguinte. No entanto, o armazenamento prolongado da amostra pode levar à redução do sinal.