Um imunoensaio multiplex baseado em grânulos para quantificar vários alvos de citocinas

Resumo

Fonte: Lehmann, J. S., et al. Perfil de citocinas multiplex de esplenócitos de camundongos estimulados usando uma plataforma de imunoensaio citométrica baseada em esferas. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra um imunoensaio multiplex baseado em esferas para quantificar vários alvos de citocinas em uma amostra. Uma mistura de microesferas distintas conjugadas a anticorpos específicos de citocinas é usada para ligar as citocinas presentes na amostra. Os repórteres marcados com estreptavidina são imobilizados nas citocinas ligadas usando anticorpos de detecção biotinilados. A citometria de fluxo identifica as citocinas ligadas com base nos tamanhos únicos e nas intensidades de fluorescência interna das microesferas, enquanto a intensidade de fluorescência dos repórteres indica o número de citocinas.

Protocolo

1. Preparação de Amostras Biológicas

NOTA: O local anatômico escolhido e o volume de coleta de sangue são deixados a critério de cada investigador individual e não afetarão o resultado do ensaio. No entanto, uma vez obtidas, as amostras devem ser manuseadas de acordo com as etapas listadas abaixo.

1. Preparação de amostras de soro
   1. Colete o volume desejado de sangue no tubo de coleta preferido e deixe-o coagular por pelo menos 30 minutos.
   2. Centrifugue a amostra por 10 min a 1.000 x g em temperatura ambiente.
   3. Remover o soro e dosear imediatamente ou a....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Centrífuga Allegra 6R com adaptador de suporte MICROPLUS	Beckman Coulter	366816	Para ensaios LEGENDplex é executado em microtubos, placa de 96 poços com fundo em V ou U (opcional)
Painel de citocinas auxiliar T do mouse LEGENDplex	BioLegend	740005	Imunoensaio multiplex (13-plex)
Anticorpo anti-camundongo CD3ε	BioLegend	100314	Clone 145-2C11, baixa endotoxina, formato livre de azida
Anticorpo anti-camundongo CD28	BioLegend	102112	Clone 37.51, baixa endotoxina, formato livre de azida
Bomba de vácuo	EMD Millipore	WP6111560	Para ensaios LEGENDplex usando placas filtrantes (recomendado)
Coletor de vácuo	EMD Millipore	MSVMHTS00	Para ensaios LEGENDplex usando placas filtrantes (recomendado)
Reservatórios de reagentes descartáveis estéreis	Fisher Científico	07-200-130	Ou equivalente
Tubos MicroFACS de polipropileno	Fisher Científico	11-842-90	Para ensaios LEGENDplex é executado em microtubos, placa de 96 poços com fundo em V ou U (opcional)
Kit de pipeta	Fisher Científico	14-388-100	Quatro tamanhos de pipeta (0,2-2 μL, 2-20 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL)
Pipeta multicanal	Fisher Científico	FA10011G	capaz de dispensar 5 μL a 200 μL
Agitador de microplacas	Fisher Científico	88880023	Ou equivalente
Microcentrífuga	Fisher Científico	75002410	Ou equivalente
Tubos FACS	Fisher Científico	NC9885747	Fundo redondo de 12 x 75 mm
PMA (Phorbol 12-miristato 13-acetato)	Sigma-Aldrich	Pág. 8139
Lipopolissacarídeo (LPS)	Sigma-Aldrich	L-8274	Escherichia coli O26:B6
Ionomicina	Sigma-Aldrich	I0634
Limpador ultrassônico Branson B200	Sigma-Aldrich	Z305359	Ou equivalente
Tubos de microcentrífuga	Sigma-Aldrich	Z666505	Tubos de polipropileno de 1,5 mL
Citômetro de fluxo	vário	vário	Citômetro equipado com laser único (azul de 488 nm) ou dois lasers (azul de 488 nm ou verde de 532 nm + vermelho de 633 nm) capaz de ler comprimentos de onda de emissão em 575 nm e 660 nm
Placa de polipropileno de 96 poços	VWR	82050-662	Para ensaios LEGENDplex é executado em microtubos, placa de 96 poços com fundo em V ou U (opcional)