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Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Isolamento de células dendríticas derivadas de monócitos associadas a tumores
- Em uma capela de fluxo laminar, remova os tumores de camundongos sacrificados com CO2 e coloque os tumores em meio RPMI sem soro fetal bovino (FBS).
nota: Raspar os camundongos e borrifá-los com etanol a 70% antes de remover os tumores é altamente recomendado para minimizar possíveis contaminações do pelo. Certifique-se de que o tumor não exceda 25 - 40 mm2, pois tumores maiores têm menos células dendríticas (DC) que tendem a ser frágeis e propensas a sofrer morte celular. Se for necessário um número maior de DC, cada camundongo pode ser injetado com células tumorais em vários locais.
- Sob um capuz laminar estéril, corte os tumores em pequenos pedaços (aproximadamente 1 x 1 mm2) usando uma tesoura cirúrgica.
- Adicione todos os fragmentos tumorais de um camundongo em um tubo estéril de fundo plano de 30 mL com barras de agitação magnéticas contendo 5 mL de solução salina balanceada de Hank (HBSS), 2 mg/mL de colagenase IV e 0,01 mg/mL de DNase I.
cuidado: As células mieloides produzem energia por meio da glicosilação, mesmo em estado estacionário. Portanto, use apenas meios que contenham glicose (por exemplo, HBSS, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)), pois a falta de glicose por apenas 10 a 15 minutos resultará em morte celular e apoptose em 24 horas. Use apenas uma colagenase IV com baixo teor de endotoxina, pois a colagenase é produzida por bactérias Gram-positivas (Clostridium histolyticum).
- Agitar a cerca de 200 - 400 rpm numa incubadora a 37 oC com agitador magnético durante 20-30 min.
- Adicione 5 mL de meio completo e ressuspenda vigorosamente.
- Filtre as células através de um filtro de células de 70 μm. Centrifugue a 4 oC 400 rcf por 5 - 10 min para peletizar as células.
cuidado: Não tente isolar as células diretamente após a digestão enzimática, pois alguns tumores são necróticos e contêm quantidades relativamente grandes de detritos celulares ou matriz extracelular. Aplique as células em um meio de gradiente de densidade de 15% para obter apenas as células.
- Suspenda 9 mL de meio de gradiente de densidade com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 10x para ajustar a osmolalidade e obter solução estoque de Percoll 100%. Misture 1,5 mL de solução de estoque de meio de gradiente de densidade com 8,5 mL de HBSS e misture vigorosamente com pellet de células derivadas de tumor. Coloque suavemente 2 mL de DMEM no topo de um meio de gradiente de densidade de 15% e centrifugue a 400 rcf por 20 min em temperatura ambiente. Descarte os sobrenadantes, pois as células formarão um pellet no fundo do tubo.
- Lave as células peletizadas duas vezes, ressuspendendo-as em 10 mL de HBSS contendo 2% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina e 10 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (tampão de isolamento) e centrifugue a 4 oC 400 rcf por 5-10 min para pellet as células.
- Conte as células em um hemocitômetro usando azul de tripano sob um microscópio óptico.
- Ressuspenda 1 x 108 células em tampão de isolamento de 1 mL e incube-as a 4 oC com 30 μL de esferas magnéticas conjugadas CD11b + por 15 min.
CUIDADO: Evite o uso de grânulos conjugados com CD11c, pois isso ativará a DC e induzirá a morte celular. Não tente bloquear FcγRII e FcγRIII com anticorpos anti-CD16/32. Os anticorpos bloqueadores ligam FcγR, induzem forte fosforilação de proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAP) e preparam a DC.
- Remova o excesso de grânulos não ligados adicionando 9 mL de tampão de isolamento e centrifugue as células a 400 rcf por 5 a 10 min a 4oC.
- Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em tampão de isolamento de 1 mL. Aplique as células em uma coluna magnética pré-lavada. Lave a coluna duas vezes com 3 mL de tampão de isolamento.
- Remova a coluna do ímã. Pipete 6 mL de tampão de isolamento na coluna e lave as células marcadas magneticamente em um tubo de coleta estéril empurrando o êmbolo. Centrifugue as células a 400 rcf por 5 - 10 min a 4 oC.
- Ressuspenda as células a 100 μL por 1 x 107 células e cove com os seguintes anticorpos conjugados com fluoróforo: Linage negativo (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI e Ly6G), MHCII, Ly-6C.
- Classifique as células bloqueando as células pequenas, usando dispersão lateral (SSC) e dispersão direta (FSC) e cultura em um meio completo suplementado com 5 ng/mL GM-CSF—Incube as células por 1 hora a 37 oC para permitir que os macrófagos adiram à placa. Em seguida, transfira as células soltas e não aderentes para uma nova placa de cultura.
nota: Os MoDC do mouse são definidos como CD11b + / CD11c + / MHCIIhi / Ly6Clo / int. A expressão de Ly6C pode variar drasticamente entre os modelos de tumor e, em alguns modelos (por exemplo, LMP), os MoDCs carecem completamente da expressão de Ly6C. Um tumor B16F10 de 100 mm3 normalmente contém 5 x 104 de DC, resultando em aproximadamente 4 - 5 x 106 células no total. Dessas células, 10 a 15% são células imunes e 8 a 10% são MoDC. O aumento dos números de DC pode ser alcançado injetando camundongos com tumores em vários locais. Classifique apenas pequenas células SSC/FCS, pois outras células mieloides podem expressar marcadores como CD11c e Ly6C.
opcional: Classifique o monócito infiltrante de tumor como pequenas células SSC / FSC que expressam Ly6Chi e são negativas para MHCII. Em seguida, cultura de monócitos in vitro com 50 ng/mL GM-CSF para obtenção de DC.
2. Preparação de Imunocomplexos Tumor-IgG
- Cultura de células tumorais em frasco de culturade 75 cm 2 a 70% de confluência em meio DMEM completo.
- Adicione 2 mL de tripsina / EDTA a 0,25% para separar as células do frasco de cultura e monitore a morfologia celular sob um microscópio óptico para evitar a tripsinização excessiva.
- Adicione 8 mL de meio de cultura completo (por 2 mL de tripsina) para inibir a digestão da tripsina e centrifugue a 4 oC, 400 rcf por 5-10 min para peletar as células.
nota: Verifique as células tumorais para Mycoplasma usando um kit de PCR comercial. Teste de bactérias Gram-negativas e endotoxinas fúngicas usando o ensaio de lisado de amebócitos Limulus (LAL)). O soro deve ser filtrado através de 0,22 μM e testado para os vírus do Código 9 de Regulamentos Federais. Além disso, teste os meios de cultura e soros colocando 100 - 200 μL em ágar LB ou caldo e cultura por 2 dias a 37 oC.
- Lave novamente as células da tripsina e dos restos de soro, ressuspendendo-as em 10 mL de PBS e centrifugue a 400 rcf por 5 a 10 min. Aspire o sobrenadante e repita a lavagem mais 2 vezes.
- Fixe as células em paraformaldeído tamponado a 1,8% por 10 min em temperatura ambiente.
- Lave as células ressuspendendo-as em 10 mL de PBS e centrifugue a 4 oC 400 rcf por 5 - 10 min.
- Aspire os sobrenadantes e repita a lavagem mais duas vezes.
opcional: Para ensaios de captação de tumor, as células podem ser marcadas incubando-as por 5 min a 37 oC em PBS contendo 1 μM de éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE). O CFSE é então temperado com meio completo por 10 min em gelo. As células devem ser lavadas extensivamente em PBS contendo 2% de soro para remover o corante residual.
- Ressuspenda as células em tampão de classificação celular ativada por fluorescência (FACS) (PBS suplementado com 2% FCS + 5 mM EDTA) e 0,5 μg/mL de anti-CD16/32 para bloquear possíveis interações proteína-proteína não específicas. Placa em forma de U 96 poços/placa a uma concentração de 1 x 105 células por 100 μL.
- Adicione diferentes diluições de anticorpos de ligação ao tumor variando de 5 μg - 5 ng / 1 x 105 células. Incube o prato no gelo por 15-20 min.
nota: Os anticorpos IgG foram isolados do soro de camundongos fêmeas virgens de 20 a 24 semanas de idade em colunas de proteína A, conforme descrito.
- Lave as células adicionando 150 μL de PBS e centrifugando a placa a 4 oC 400 rcf por 5 - 10 min.
- Rejeitar os sobrenadantes e repetir a lavagem duas vezes. Ressuspenda as células em tampão FACS de 100 μL contendo anticorpo secundário conjugado com fluoróforo. Incube o prato no gelo por 20 min.
- Lave as células adicionando 200 μL de tampão FACS e centrifugando a placa a 400 rcf por 5 a 10 min. Descarte os sobrenadantes e repita a lavagem.
- Analise a ligação do tumor por citometria de fluxo e determine a concentração mínima necessária para revestir as células.
nota: Anticorpos que não aumentam a intensidade média de fluorescência (MFI) de células tumorais coradas em pelo menos cinco vezes em relação ao controle de isotipo não devem ser usados em ensaios funcionais subsequentes.
3. Ativação do MoDC com CI Tumor-IgG
- Revestir células tumorais com concentração mínima de IgG, conforme descrito nas secções 2.1 a 2.4.3
- Um dia antes de ativar o MoDC com CI tumoral, substitua os meios de cultura MoDC contendo GM-CSF. Para isso, aspire suavemente o meio e lave as células uma vez com meio de cultura completo pré-aquecido.
nota: O MoDC associado a tumor maduro isolado deve ser cultivado por pelo menos 2 a 3 h (ou mesmo durante a noite) após a classificação em meio completo sem GM-CSF e antes de ativá-los com IC.
- Para análises de captação de tumor, adicione o IC tumoral marcado com CFSE ao MoDC na proporção de 1:5 (IC: MoDC) e incube durante a noite por 12 a 16 h em 1 mL de meio completo por 1 x 106 DC.
- Para análises FACS de experimentos de ativação MoDC, adicione tumor-IC na proporção de 1:1 (IC: MoDC) e incube durante a noite por 12 a 16 h.
nota: A inclusão de um poço de controle positivo é altamente recomendada, na qual os MoDC são estimulados com 1 μg/mL de LPS ou outros agonistas de TLR.
- Após a ativação durante a noite, aspire os sobrenadantes e lave as células suavemente três vezes com tampão de isolamento ou 10 mM EDTA HBSS.
- Para separar DC da placa, incube as células por 2 a 3 min em HBSS de 1 mL contendo 10 mM de EDTA e retire as células por pipetagem vigorosa.
- Centrifugue as células a 400 rcf e ressuspenda 1 x 106 DC em 90 μL de PBS suplementado com 2% de FCS, 5 mM EDTA (FACS buffer) e 0,5 μg de anticorpos bloqueadores. Incube no gelo por 5 a 10 min.
- Adicione 10 μL de mistura de anticorpos de coloração às células e incube no gelo por 15 min.
- Adicione 2 mL de tampão FACS às células e centrifugue a 4 oC 400 rcf por 5 - 10 min.
- Ressuspenda as células em tampão FACS de 200 μL.
- Adicione 0,5 - 1 μg/mL de DAPI 1 - 2 min antes de executar as amostras para excluir as células mortas das análises. Não incube demais o DAPI, pois o MoDC o levará dentro de 10 a 15 minutos.