Detecção de proteínas príon anormais no tecido cerebral usando imuno-histoquímica

Abstract

Fonte: Orge, L., et al. Detecção de proteína príon anormal por imuno-histoquímica. J. Vis. Exp. (2023).

Este vídeo demonstra uma técnica para detectar proteína príon mal dobrada em seções cerebrais usando imuno-histoquímica. Ao tratar a seção cerebral com ácido fórmico para desnaturar príons e minimizar o risco de infecção, bem como desmascarar os agregados de príons usando a recuperação de epítopos induzida por calor, as seções são imunomarcadas para os agregados de proteína de príon mal dobrados e observadas ao microscópio.

Protocol

1. Seccionamento de tecido e preparação de lâminas

1. Corte seções de tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) com 3-5 μm de espessura usando um micrótomo.
2. Flutuar as secções em água purificada com uma temperatura cerca de 10 °C abaixo do ponto de fusão da parafina utilizada. Levante as seções da água em lâminas de microscópio especialmente tratadas (consulte a Tabela de Materiais). Deixe a água escorrer completamente das lâminas.
3. Incube as lâminas durante a noite a 50 °C para aumentar a adesão dos tecidos à lâmina.
   nota: É preferível preparar tecidos recém-seccionados para protocolos de IHC, embora os cortes de controle positivo e negativo de EET possam ser preparados com antecedência e armazenados. As etapas 2 a 4 devem ser executadas em uma capela de exaustão química.

2. Desparafinização e reidratação

1. Coloque as lâminas com as seções de tecido em uma cesta de coloração de aço inoxidável (consulte a Tabela de Materiais). Mergulhe a cesta em um banho de xileno (recipiente de coloração de aço inoxidável) por 3 min, remova e mergulhe novamente.
2. Remova o xileno e reidratie as seções mergulhando-as em um banho de etanol absoluto por 3 min. Remova e mergulhe mais uma vez.
3. Seque as seções ao ar e coloque em um banho de etanol a 90% por 1 min. Transfira para um banho de etanol a 70% por mais um minuto, seguido de uma transferência final para um banho de etanol a 50% por 1 min. Para cada tratamento de banho de etanol, agite suavemente a cesta deslizante duas vezes e drene a cesta antes da próxima transferência.

3. Recuperação de epítopos

1. Mergulhe cuidadosamente as seções de tecido em ácido fórmico a 98% em temperatura ambiente por 30 min. Enxágue as seções em água da torneira por 5 min, seguido de enxágue duas vezes em água destilada.
   cuidado: O ácido fórmico é altamente corrosivo. Óculos e luvas de proteção devem ser usados.
2. Realize a Recuperação de Antígeno Induzida por Calor (HIER) seguindo as etapas abaixo.
   nota: Esta etapa é realizada por autoclavagem hidratada a 121 °C por 30 min em uma câmara de pressão específica (ver Tabela de Materiais).
   1. Pré-aqueça o tampão citrato (10 mM, pH 6,1, consulte a Tabela de Materiais) a 98 ° C por cerca de 20 min em um recipiente de coloração de aço inoxidável colocado dentro da câmara de pressão cheia com 500 mL de água destilada.
      nota: Para o presente estudo, o Ponto de Ajuste do programa foi 1 (SP1) para o equipamento específico utilizado.
   2. Após o alarme indicar que o equipamento atingiu o tempo e a temperatura programados, mergulhe a cesta com lâminas e inicie o programa para o Set Point 2 (121° C por 30 min). Para fins de controle de qualidade, coloque uma seção de fita indicadora de autoclave adesiva na cesta para monitorar a temperatura e a pressão e registre a pressão inicial e final deste programa.
   3. Se o número de lâminas a serem imunomarcadas não atingir a capacidade da cesta, use lâminas limpas e em branco para ocupar as posições vazias. Após o término do programa, permitir o retorno passivo da câmara à pressão ambiente (pelo menos 30 min).
      nota: Durações mais longas podem reduzir a coloração de fundo não específica.
   4. Transfira cuidadosamente a cesta deslizante para um recipiente de coloração de aço inoxidável cheio de água destilada por 5 min.

4. Inativação da peroxidase endógena

1. Mergulhe o cesto de lâminas contendo as secções de amostra num banho de peróxido de hidrogénio a 3% (H₂O₂) em metanol durante 30 min. Lave as secções em água corrente (5 min). Drene e mergulhe as seções em 1x solução salina tamponada com Tris (TBS) por mais 5 min.

5. Imunodetecção

NOTA: Para o presente estudo, a imunodetecção foi executada usando o formato de gap capilar usando um sistema de montagem de clipe de lâmina disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais). Outros sistemas de lâminas de imuno-histoquímica também são aplicáveis.

1. Coloque cada lâmina em um suporte de placa de cobertura disponível comercialmente (consulte Tabela de Materiais) pré-umedecido com TBS, evitando bolhas, com o lado do tecido voltado para o suporte e as bordas da lâmina coincidindo com os dois pontos inferiores do suporte.
   1. Segure o conjunto do porta-lâminas entre o polegar e o indicador, com um dedo na parte superior do sample slide e o outro na parte inferior do suporte. Em seguida, coloque o assembly na galeria do sistema.
   2. Para garantir que o conjunto esteja bem montado, encha o poço entre a lâmina de amostra e o suporte com TBS, que não deve transbordar imediatamente. A partir deste ponto, certifique-se de que aproximadamente 80 μL de TBS devem ser retidos entre o suporte e a lâmina. Não deixe as seções secarem.
2. Uma vez no sistema, para diminuir a coloração de fundo antes do tratamento com anticorpo primário (anticorpo contra proteínas priônicas (anti-PrP), consulte a Tabela de Materiais), pré-incube as lâminas de amostra com 20% de soro normal da mesma espécie que o hospedeiro de anticorpo secundário sendo usado para imunocoloração (no presente caso, soro de cavalo) por 30 min em TBS.
3. Descongelar o número de alíquotas de anticorpos a serem utilizadas de acordo com a espécie animal em análise, o número de seções de amostra a serem examinadas e a quantidade de diluição de trabalho.
   nota: Para obter melhores resultados, use soro normal a 10% da mesma espécie que a fonte das soluções de anticorpos secundários e primários. Se possível, para obter melhores resultados, a fonte hospedeira do soro normal e do anticorpo secundário deve ser da mesma espécie.
4. Sem lavar as secções, aplicar a solução de anticorpos primários directamente (200 μL) em cada alvéolo do conjunto porta-lâminas e incubar durante 60 min à temperatura ambiente.
5. Para lavar, encha os poços dos conjuntos porta-lâminas com TBS e aguarde 5 min. Repita duas vezes.
6. Dilua o anticorpo secundário biotinilado (monoclonal anti-murino Horse Ab, ver Tabela de Materiais) a 1/200 em TBS com 10% de soro de cavalo. Prepare o volume necessário em função do número de secções a tratar.
7. Aplicar a solução de anticorpos secundários (200 μL) em cada alvéolo do conjunto porta-lâminas. Incubar por 30 min em temperatura ambiente.
8. Lave conforme descrito na etapa 5.5.
9. Para incubação com peroxidase do complexo avidina-biotina (complexo ABC/HRP, ver Tabela de Materiais), prepare o reagente 30 minutos antes da utilização. Aplicar a solução complexa ABC/HRP (200 μL) em cada alvéolo do conjunto porta-placas deslizantes. Incubar por 30 min em temperatura ambiente.
10. Lave conforme descrito na etapa 5.5.

6. Desenvolvimento com cromogênio 3,3' diaminobenzidina (DAB)

CUIDADO: DAB é um potencial cancerígeno. Como resultado, são necessários cuidados adequados ao trabalhar com este reagente, incluindo proteção para os olhos, jalecos, luvas e bons procedimentos laboratoriais. Descarte os regulamentos locais.

1. Dilua o cromogênio de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais) imediatamente antes de usar. Aplicar a solução de cromogénio (400 μl) em cada alvéolo do conjunto de placas deslizantes.
2. Incube por até 30 min em temperatura ambiente. Em seções positivas para^{PrP Sc} (isoforma anormal de proteínas príons), um período de incubação de 10 minutos geralmente é suficiente.
3. Remova a solução de cromogênio residual lavando as lâminas em água destilada. Remova as lâminas dos suportes da placa de cobertura e coloque-as em um recipiente plástico com água destilada.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Etanol absoluto	Labchem	LB0507-9010	Diluído
			Diluído a 90%, 70% e 50% em água destilada
Complexo avidina-biotina e peroxidase Kit Vectastain Elite ABC Peroxidase	Laboratórios de vetores	PK-6100	Prepare e misture delicadamente 30 minutos antes de usar de acordo com as instruções do kit. Não misture depois de repousar.
Anticorpo secundário biotinilado (IgG H+L anti-camundongo de cavalo)	Laboratórios de vetores	BA-2000-1.5	Diluir a 1/200 em TBS com 10% de soro normal de cavalo. Prepare o volume necessário dependendo do número de seções.
Cromogênio Diaminobenzidina- DAB, kit de substrato, Peroxidase	Laboratórios de vetores	SK-4100	Prepare antes de usar de acordo com as instruções do kit. Use 400 μL de solução por seção.
Câmara de pressão DakoCytomation Pascal	DAKO	S2800
Hematoxilina de Ehrlich:
Etanol absoluto	Labchem	LB0507-9010
Ácido acético glacial	Merck	Rolamento 101830
Alúmen de potássio	Merck	Rolamento 1.01047.1000
Glicerina	Merck	1.04091.1000
Solução de bloco de peroxidase endógena (concentração de 3% H2O2):			40 mL de peróxido de hidrogênio (30% p/p) em 360 mL de metanol. Preparar antes de usar
Peróxido de hidrogênio (30% p/p)	Scharlau	HI0136
metanol	Sigma Aldrich	322415-2L
Ácido fórmico 98%	Merck	Rolamento 1.00264.1000	Diluído
Micrótomo	Shandon-AS325	Micrótomo	Shandon-AS325
Solução de bloco de soro normal (20%) em TBS: Soro normal para cavalos	Gibco	16050-122	Preparar o volume final de acordo com o número de seções no ensaio (200 μL de solução por seção).
Anticorpo primário anti-PrP Camundongo MAb 2G11	BIORAD	MCA2460	PrP 146-R154R171182 Ovino, incluindo scrapie atípico, cervina, felino. Não é adequado para bovinos. De acordo com o número de cortes no ensaio (200 μL de solução por seção) e diluição do anticorpo, preparar o volume final em TBS suplementado com 10% de soro normal da espécie em que o anticorpo secundário foi elevado (soro normal de cavalo) Diluição usual de anticorpos: MAb 2G11 1/100, mas a diluição de trabalho deve ser estabelecida em cada novo lote para obter a concentração para dar a rotulagem mais forte com o fundo mais baixo. Para armazenamento, congele volumes de alíquotas de no mínimo 10 μL em microtubos estéreis. Descongele e use uma alíquota de cada vez.
Anticorpo primário anti-PrP Camundongo MAb 12F10	Companhia Química Cayman	Rolamento 189710	PrP142-160 Bovinos, não adequados para ovinos Diluição usual de anticorpos: 1/200, mas a diluição de trabalho também deve ser estabelecida. Prepare-se como MAb 2G11
Câmara Shandon CoverplateTM	Thermo Científico	72110017
Centro de Imuncoloração Shandon Sequenza®	Thermo Científico	73300001
Shandon Sequenza® Immunstaining rack de slides	Thermo Científico	73310017
Tampão citrato de solução (10 mM pH 6,1):			2,55 g de citrato trissódico di-hidratado e 0,255 g de ácido cítrico em um litro de água purificada. Ajuste o pH da solução de trabalho para 6,1 usando solução de ácido cítrico 10 mM (1,05 g de ácido cítrico em 500 mL de água purificada) Prepare-se no dia do ensaio.
Citrato trissódico di-hidratado	Sigma-aldrich	S4641-500G
ácido cítrico	Sigma Aldrich	C0759
Frasco e cesta de coloração	Laboratório delta	19360
		Rolamento 19361
Lâminas de microscópio Superfrost Plus	VWR	Nº 631-0108
Solução salina tamponada com Tris (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; NaCl 0,8%; pH 7,6):			10xTBS (solução estoque 0,5 M TRIZMA BASE; NaCl 8%; pH 7,6): TRIZMA BASE 60,57 g e NaCl 80 g em 800 mL de água purificada. Ajuste o pH da solução estoque usando ácido clorídrico a 37% e o volume final para um litro com água purificada (mantenha 5± 3 °C até 2 meses) Diluir a solução-mãe TBS 1/10 no dia do ensaio.
TRIZMA BASE	Sigma Aldrich	T6066-1KG
Cloreto de sódio (NaCl)	Merck	106404
xileno	Reagentes Panreac Applied Chem ITW	251769	Diluído