1. Preparação dos imunógenos
- Cultive cada cepa de cianobactéria no meio de cultura correspondente nas condições descritas na Tabela 1.
NOTA: O meio de crescimento e as condições de cultura para cada cepa de cianobactéria estão listados na Tabela 1. Todas as cepas de cianobactérias, com exceção da K17, pertencem ao grupo de Antonio Quesada da Universidade Autônoma (Madri, Espanha). O anticorpo contra Planktothrix rubescens foi gerado a partir de uma amostra natural da floração monoespecífica desta cianobactéria do reservatório de Vilasouto (norte da Espanha).
- Quantifique o número de células usando uma câmara de contagem de células por microscopia óptica para obter aproximadamente 108 células / mL de uma cultura de fase de crescimento exponencial tardio ou estacionária.
- Colher células de 5 mL de cultura por centrifugação a 2.000 x g por 5 min.
- Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em um tubo de 10 mL com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato 1x (1x PBS) para obter cerca de 108 células/mL.
- Homogeneizar e lisar as células da suspensão por sonicação por 5 ciclos, 30 s cada, com uma pausa de 30 a 60 s no gelo, usando um processador ultrassônico portátil ou mergulhando o tubo no banho-maria de um disruptor celular na amplitude máxima (30 kHz).
- Repita as etapas 1.3 a 1.5 para cada cepa de cianobactéria.
NOTA: A sonicação produz ruptura celular e liberação de conteúdo celular. Embora proteínas e polissacarídeos sejam bons imunógenos, moléculas específicas, como lipídios e ácidos nucléicos, não induzem uma resposta imunogênica humoral por si mesmas. Portanto, eles devem se ligar a transportadores, como polissacarídeos ou proteínas, para aumentar a complexidade molecular. Além disso, a sonicação libera material intracelular que pode desencadear a produção de anticorpos.
2. Produção de anticorpos policlonais
- Prepare a primeira dose de imunógeno misturando 0,5 mL do lisado de células ultrassônicas obtido na etapa 1.5 com 0,5 mL de adjuvante de Freund completo. Entregue-o ao operador de uma instalação animal para produção de anticorpos policlonais de coelho.
- Prepare mais três doses como antes para uso posterior como aumento de memória no processo de produção de anticorpos, misturando 0,5 mL do mesmo homogeneizado/lisado obtido na etapa 1.5 com 0,5 mL de adjuvante de Freund incompleto. Dê-os ao biotério para cumprir o processo de produção de anticorpos.
- Repita as etapas 2.1 e 2.2 para cada novo processo de produção de anticorpos.
NOTA: Normalmente, a produção de anticorpos é confiada a instalações ou empresas especializadas em animais, pois são necessários licenciamento e treinamento adequados para trabalhar com animais. As empresas fornecem uma medição relativa de ensaio imunoenzimático (ELISA) da quantidade de anticorpos específicos do antígeno presentes na amostra de soro.
3. Purificação de anticorpos
- Purificar a fracção de imunoglobulina G (IgG) do soro imunitário e pré-imune colhido na fase 2 por cromatografia de afinidade com a proteína A. Alguns kits de purificação comerciais, baseados em sistemas de cartucho, funcionam bem; Siga as instruções do provedor.
- Quando o kit de purificação não fornecer um sistema de dessalinização, troque o tampão após a eluição dos anticorpos purificados para 0,1x PBS, seja por diálise ou usando dispositivos de filtro centrífugo com um tamanho de poro de membrana de 100 kDa (ou inferior).
- Determinar a concentração de anticorpos medindo a absorbância a 280 nm ou utilizando métodos colorimétricos, tais como Bradford, Lowry ou ácido bicinconínico (BCA).
NOTA: É importante evitar a inclusão de grupos amina no tampão de eluição (por exemplo, tampões Tris) porque eles competem com o anticorpo pela ligação a superfícies sólidas ativadas com grupos epóxi. Após a purificação, é importante testar a atividade do anticorpo com ELISA.
4. Rotulagem de anticorpos de fluorescência
- Rotule os anticorpos purificados obtidos na seção 3 com um fluorocromo (por exemplo,., um corante fluorescente vermelho distante) dissolvendo um frasco comercial contendo corante para rotular 1 mg de proteína em 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO). Adicione 2 μL do corante dissolvido a cada preparação de anticorpos a uma concentração de 2 mg / mL em um volume final de 50 μL em solução salina tamponada com fosfato 50 mM (pH 8,5).
- Manter as reações de rotulagem sob agitação contínua por 1 h à temperatura ambiente e 1.200 rpm em plataforma vibratória.
- Purifique os anticorpos marcados por cromatografia de exclusão de tamanho (por exemplo, usando um gel com uma faixa de fracionamento entre 1,5 e 30 kDa preso em uma coluna), seguindo as recomendações do fornecedor.
- Meça a absorbância a 280 nm e a 650 nm em eluatos e calcule as eficiências de rotulagem seguindo as recomendações do fornecedor.
NOTA: Até 50 x 50 μL de reações de marcação de anticorpos podem ser feitas com um único frasco do corante fluorescente para marcar 1 mg de proteína. Recomenda-se cobrir os tubos com papel alumínio ou, alternativamente, usar tubos opacos de 0,5 mL para evitar processos de têmpera após a etapa 4.3. Para anticorpos IgG, a marcação ideal é alcançada com 3-7 mol do corante por mol de anticorpo.
5. Produção de CYANOCHIP
- Anticorpos e controles na solução de impressão
- Prepare 30 μL de cada anticorpo purificado em solução de impressão, misturando cada anticorpo a 1 mg / mL em um tampão de impressão de proteína comercial 1x com 0,01% (v / v) Tween 20 (um detergente não iônico), tudo como concentrações finais.
NOTA: Alternativamente, uma solução de anticorpos pode conter 20% de glicerol, 1% (p / v) de sacarose (ou trealose, como conservante) e 0,01% (v / v) de Tween 20 em tampão de carbonato (pH 8,5).
- Prepare 30 μL da solução de impressão como controles: (a) 1x tampão de impressão de proteína com 0,01% (v / v) Tween 20, (b) soro pré-imune purificado de proteína-A a 1 mg / mL em 1x tampão de impressão de proteína com 0,01% (v / v) Tween 20 e (c) albumina de soro bovino (BSA) a 1 mg / mL em 1x tampão de impressão de proteína com 0,01% (v / v) Tween 20.
- Prepare 30 μL de um soro pré-imune purificado e marcado com fluorescência em diferentes concentrações (por exemplo, de 50 μg / mL a 1 μg / mL) em 1x tampão de impressão de proteína com Tween 20, como na etapa 5.1.1. Essas amostras serão usadas como marcadores de quadro fluorescente e para quantificação de fluorescência relativa após spotting.
- Adicione 30 μL por poço das soluções de impressão preparadas nas etapas 5.1.1, 5.1.2 e 5.1.3 às microplacas de 384 poços da mais alta qualidade para fabricação de microarrays, como polipropileno.
NOTA: O tampão de impressão de proteínas aumenta a qualidade e a estabilidade dos anticorpos, e o Tween 20 homogeneíza a morfologia do ponto e aumenta o acoplamento de proteínas. Recomenda-se manter a microplaca de 384 poços a 4 °C antes de usar. Armazene-o a -20 °C por longos períodos de tempo. O polipropileno tem baixo DNA, proteína, extrato celular e ligação intrínseca de moléculas pequenas.
- Impressão de anticorpos em uma lâmina de microscópio
NOTA: Imprima os anticorpos em lâminas de microscópio ativadas usando diferentes plataformas de matriz, como dispositivos de contato, agulha dividida ou sem contato, como impressoras piezoelétricas ou tecnologias de "jato de tinta". Neste trabalho, o CYANOCHIP foi rotineiramente impresso por contato usando um sistema robótico (arrayer) capaz de detectar quantidades nL dos anticorpos na escala μm.
- Defina as condições ambientais da sala de impressão para 20 °C e 40 - 50% de umidade relativa.
- Configure os substratos da lâmina (por exemplo, lâminas de vidro de microscópio ativadas por epóxi de 75 x 25 mm) para executar várias matrizes de anticorpos idênticas em cada lâmina.
- Identifique cada anticorpo purificado, incluindo os controles e o quadro de referência, em um padrão de pontos triplicados; nessas condições, os pontos têm 180 a 200 μm de diâmetro.
- Após a impressão, deixe as lâminas por pelo menos 30 min em temperatura ambiente para deixá-las secar e, em seguida, armazene-as a 4 °C; para trabalhar em campo, as lâminas podem ser transportadas e armazenadas em temperatura ambiente por vários meses.
NOTA: O CYANOCHIP é impresso em um formato de microarray de ponto triplicado com 3 x 8 microarrays idênticos por slide ou 9 arrays idênticos em um formato de microarray de 1 x 9. Cada tamanho de matriz não deve ser maior que as dimensões da câmara de reação para uma junta de 24 poços (geralmente 7,5 x 6,5 mm em uma câmara de hibridização 3 x 8).
- Antes de usar o microarray para analisar amostras ambientais, use o imunoensaio de microarray em sanduíche fluorescente (FSMI) para determinar a diluição de trabalho para cada anticorpo em uma curva de titulação. Para cada anticorpo, use uma concentração padrão do imunógeno correspondente (103 - 104 células / mL) e diluições seriadas do anticorpo fluorescente (entre 1:500 e 1:32.000). A concentração ideal de anticorpos corresponde a 50% da intensidade máxima do sinal obtida na curva de titulação. Além disso, a sensibilidade e a especificidade de cada anticorpo devem ser determinadas, conforme descrito em Blanco et al.
6. Preparação de Extratos Multianalitos Ambientais para o Imunoensaio de Microarranjo Sanduíche Fluorescente (FSMI)
- Extrato multianalito de uma amostra líquida
- Pegue 1 a 100 mL da amostra líquida com uma seringa estéril (por exemplo, água da margem de um reservatório de água); a quantidade de amostra depende muito da concentração potencial dos alvos.
- Concentrar as células passando a amostra de água através de um filtro de policarbonato de 47 mm de diâmetro; uma concentração celular entre 103 - 108 células/ml é desejável para uma detecção positiva, mas a concentração real é desconhecida.
- Recupere a biomassa coletada no filtro com 1 mL de solução salina tamponada com Tris modificada, tampão reforçado com Tween 20 (TBSTRR; 0,4 M Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl e 0,1% Tween 20) raspando-o com uma espátula em um tubo de 15 mL.
- Homogeneizar e desagregar usando um processador ultrassônico portátil, conforme descrito na etapa 1.5, ou apenas pipetando para cima e para baixo várias vezes; isso prepara a amostra para análise pelo microarray.
- Extrato de multianalito de uma amostra sólida
- Pese até 0,5 g da amostra sólida (por exemplo, rocha, solo ou sedimentos) em um tubo de 10 mL e adicione até 2 mL de TBSTRR.
- Sonicar imergindo a sonda sonicadora no tubo, mergulhando o tubo no banho-maria de um chifre sonicador potente ou usando um sonicador portátil. Execute pelo menos 5 ciclos de 30 s a 30 kHz, parando por 30 s enquanto estiver no gelo.
- Filtro para remover areia, argila e outros materiais grossos com uma seringa de 10 mL acoplada a um porta-filtro de nylon de 10 a 12 mm de diâmetro e poro de 5 a 20 μm. Empurre a amostra através do filtro para um tubo de 1,5 mL. Se o filtro saturar, agite a suspensão na seringa e leve-a para uma nova; Isso prepara o material filtrado para o imunoensaio (etapa 7).
NOTA: A capacidade de buffer do TBSTRR depende do tipo de amostra. É importante realizar o imunoensaio imediatamente após a preparação do extrato ambiental para evitar o efeito da degradação enzimática nos analitos. Em alternativa, adicionar inibidores de protease ao extracto ambiental e congelar a -80 °C até ao passo seguinte.
7. Imunoensaio de Microarray Sanduíche Fluorescente (FSMI)
- Bloqueando o CYANOCHIP
NOTA: Imediatamente antes de usar, trate as lâminas impressas para bloquear todos os grupos epóxi livres na lâmina e remover o excesso de anticorpos não ligados covalentemente.
- Mergulhe o microarray em Tris-HCl 0,5 M (pH 9) com solução de BSA a 5% (p / v) em uma superfície limpa (por exemplo, placa de Petri ou um tubo de 50 mL) com agitação leve de uma plataforma basculante por 5 min. Como alternativa, coloque a lâmina em uma gota de 100 a 200 μL da solução acima com os pontos do microarray voltados para ela. Deixe por 3 a 5 minutos e prossiga.
- Pegue cuidadosamente a lâmina usando uma pinça com ponta de plástico; tente evitar tocar nas zonas de microarray. Elimine o excesso de líquido batendo suavemente a lâmina em uma toalha de papel. Mergulhe-o em Tris-HCl 0.5 M (pH 8) com solução BSA a 2% (p / v) por 30 min com agitação suave de uma plataforma basculante.
- Seque a lâmina realizando uma centrifugação curta (200 - 300 x g por 1 min) usando uma microcentrífuga comercial adaptada para lâminas de microscópio. Como alternativa, seque a lâmina batendo suavemente em uma toalha de papel.
- Incubação do extrato de amostra multianalito com o microarray
- Configure a lâmina em um de hibridização de microarray comercial com 24 poços para vários microarrays; siga as instruções do provedor.
- Após a montagem da lâmina e do, pipetar até 50 μL do extrato da amostra ou uma diluição dele em TBSTRR em cada poço do.
- Repita a etapa 7.2.2 para cada amostra a ser analisada.
- Como controle em branco, pipetar 50 μL de tampão TBSTRR em pelo menos dois poços separados do.
- Incubar à temperatura ambiente durante 1 h com mistura pipetando a cada 15 minutos ou deixando-o sob agitação suave. Em alternativa, incubar durante 12 h a 4 °C.
NOTA: Use outras juntas de incubação em função do padrão de microarray. O tempo e a temperatura da incubação na etapa 7.2.5 são parâmetros empíricos que normalmente dependem da afinidade e da cinética de ligação de cada par antígeno-anticorpo.
- lavagem
- Remova as amostras colocando o no chão e batendo-o cuidadosamente em um papel limpo e absorvente.
- Lave os poços adicionando 150 μL de TBSTRR a cada um e elimine o tampão, como acima.
- Repita a etapa 7.3.2 mais três vezes.
- Incubação com anticorpos detectores fluorescentes
- Adicione 50 μL de uma mistura de anticorpos contendo os 17 anticorpos anti-cepa cianobacteriana, cada um marcado com o fluorocromo em TBSTRR com 1% (p / v) de BSA. Determinar a concentração de cada anticorpo fluorescente na mistura (de 0,7 a 2 μg/ml) através da realização de experiências de titulação de cada par antigénio/anticorpo.
- Incubar durante 1 h à temperatura ambiente, conforme descrito no passo 7.2.5, ou durante 12 h a 4 °C.
- Lavando os anticorpos fluorescentes
- Remova os anticorpos fluorescentes não ligados, como na etapa 7.3.
- Desmonte o e mergulhe a lâmina em 0.1x PBS (por exemplo, em um tubo de 50 mL) para um enxágue rápido.
- Seque a lâmina como na etapa 7.1.3.
8. Varredura de fluorescência
- Digitalize a lâmina para detecção de fluorescência no pico máximo de fluorescência de emissão para corante fluorescente vermelho distante em um scanner para fluorescência. Tire várias imagens dos microarrays em diferentes parâmetros de varredura, geralmente diminuindo o valor de ganho do laser.
nota: Evite manchas saturadas (> 65.000 contagens de fluorescência) - elas estão fora de escala e podem introduzir erros de quantificação.
Tabela 1. Lista dos anticorpos (Abs) e das cepas de cianobactérias usadas para produzir o CYANOCHIP.
| Código Ab | Imunógeno (cepa) | ordem | habitat | Média | Condições de cultura |
| K1 | Anabaena sp. | Nostocales | desconhecido | BG11 e nitrato | 30 ºC, luz contínua |
| K2 | Anabaena sp. | Nostocales | desconhecido | BG11o | 30 ºC, luz contínua |
| K3 | Microcystis flosaquae | Chroococcales | planctônico | BG11 | 28 ºC, luz contínua |
| K4 | Microcystis novacekii | Chroococcales | planctônico | BG11 | 28 ºC, luz contínua |
| K5 | Microcystis aeruginosa | Chroococcales | planctônico | BG11 | 28 ºC, luz contínua |
| K6 | Aphanizomenon ovalisporum | Nostocales | planctônico | BG11o | 28 ºC, luz contínua |
| K7 | Phormidium sp. | Oscillatoriales | Benthic | BG11 | 18 ºC, fotoperíodo 16-8 |
| K8 | Rivularia sp. | Nostocales | Benthic | CHU-D | 18 ºC, fotoperíodo 16-8 |
| K9 | Chamaesiphon sp. | Chroococcales | Benthic | BG11 | 18 ºC, fotoperíodo 16-8 |
| K10 | Leptolyngbya boryana | Oscillatoriales | Benthic | BG11 | 18 ºC, fotoperíodo 16-8 |
| K11 | Tolypothrix distorta | Nostocales | Benthic | BG11o | 18 ºC, fotoperíodo 16-8 |
| K12 | Aphanizomenon aphanizomenoides | Nostocales | planctônico | BG11o | 28 ºC, luz contínua |
| K13 | (Antártica) | Nostocales | Benthic | BG11o | 13 ºC, fotoperíodo 16-8 |
| K14 | Anabaena sp. | Nostocales | Benthic | BG11o | 13 ºC, fotoperíodo 16-8 |
| K15 | Leptolyngbya sp. | Oscillatoriales | Benthic | BG11 | 13 ºC, fotoperíodo 16-8 |
| K16 | Tolypothrix sp. | Nostocales | Benthic | BG11 | 13 ºC, fotoperíodo 16-8 |
| K17 | Planktothrix rubescens | Oscillatoriales | planctônico | nenhum | nenhum |