Imunomarcação de células encapsuladas em um sistema de hidrogel 3D

Resumo

Fonte: LeSavage, B. L., et al. Produção de hidrogéis de proteína semelhantes à elastina para encapsulamento e imunocoloração de células em 3D. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra uma técnica para imunomarcar células encapsuladas em um hidrogel 3D. A cultura de hidrogel contendo células progenitoras neurais é fixada, permeabilizada e tratada com uma solução de bloqueio para evitar imunomarcação inespecífica. Um coquetel de anticorpos primários é adicionado para ligar proteínas específicas, seguido por anticorpos secundários marcados com fluorescência e uma coloração nuclear. A amostra é então montada em uma lâmina e observada em um microscópio confocal.

Protocolo

1. Encapsulamento celular em hidrogéis de proteína semelhante a elastina (ELP) 3D

1. Preparação de moldes de silicone
   1. Use um punção de biópsia com o diâmetro desejado para criar furos em uma folha de silicone de 0,5 mm de espessura e corte um quadrado ao redor de cada furo. Repita para o número de moldes desejados.
      NOTA: O diâmetro e a espessura dos moldes podem ser ajustados para as condições específicas de aplicação e cultura de células. Na prática, para culturas de células de 50 x 10⁶ células/mL, moldes de 0,5 mm de espessura com diâmetros de 4 mm e 5 mm são recomendados para extração suficiente de DNA/RNA e proteína, respectivamente. Para imunocoloração, um punção de biópsia de 2 mm pode ser usado para criar três orifícios adjacentes por molde quadrado, de modo que três réplicas possam ser coradas por poço.
   2. Remova o filme plástico de cada lado do molde individual com uma pinça.
      nota: Evite o contato com a superfície de silicone exposta, pois a contaminação pode diminuir a eficiência futura da ligação do plasma.
   3. Usando uma pinça, organize o mesmo número de moldes de silicone nus e lamínulas de vidro (nº 1, 12 mm de diâmetro) em fileiras alternadas na tampa invertida de uma placa de 48 poços. Depois de concluído, cubra a tampa da placa de 48 poços para evitar contaminação.
   4. O plasma de oxigênio trata toda a tampa da placa de 48 poços (ou seja, moldes e lâminas de vidro). Imediatamente depois, use uma pinça para inverter o molde de silicone na lamínula de vidro adjacente. Pressione firmemente o molde para garantir a colagem. Deixe os moldes incubarem em temperatura ambiente por 1 h.
      nota: A duração do tratamento com plasma de oxigênio varia de acordo com o instrumento usado. As condições típicas para o nosso instrumento são uma janela de pressão de gás operacional entre 0,3-4 mbar, fluxo de gás oxigênio a 20 cm³/min e exposição da amostra ao plasma por 10-20 s.
   5. Esterilize os moldes em autoclavagem. Armazene os moldes em temperatura ambiente em ambiente estéril até o uso.
      nota: Os moldes podem ser armazenados nesta fase indefinidamente.
2. Preparação de solução de reserva de proteínas sob a forma de elastina
   1. Remova o ELP liofilizado do armazenamento a 4 °C. Aqueça a proteína à temperatura ambiente antes de abrir o tubo para garantir que nenhuma condensação se acumule na proteína durante o uso repetido.
   2. Dissolva o ELP na solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) a 4 ° C com agitação constante (ou seja, centrifugação) durante a noite.
      nota: A concentração da solução estoque ELP será diluída ainda mais com a adição de solução de reticulador em uma proporção volumétrica definida pelo usuário. Por exemplo, para uma concentração final de ELP de 3% (p / v), prepare uma solução estoque de ELP de 3,75% (p / v) que será diluída a uma proporção volumétrica de 4: 1 de solução ELP: solução de reticulador. Ajuste a concentração conforme necessário para a aplicação desejada.
   3. Filtro estéril ELP solução estoque usando um filtro de seringa de 0,22 μm. Armazene o ELP no gelo quando não estiver em uso.
3. No gabinete de biossegurança, transfira os moldes estéreis usando uma pinça estéril para uma placa de cultura de tecidos de 24 poços.
4. Preparação de solução de solução de cloreto de fosfônio (THPC) de tetraquis(hidroximetil)fosfônio (THPC)
   1. Dilua o THPC em DPBS imediatamente antes de usar. Ajuste a concentração da solução de THPC de acordo com a concentração final de ELP e a taxa de reticulação desejada.
      nota: Para o protocolo, uma concentração final de ELP de 3% (p/v) será feita misturando a solução estoque de ELP com a solução de THPC em uma proporção volumétrica de 4:1. Ajuste conforme necessário.
   2. Adicione 2,6 μL de solução de THPC (80% em água) a 997,4 μL de DPBS.
      nota: Esta concentração de THPC corresponde a uma proporção estequiométrica de 1:1 de grupos hidroximetil no THPC e aminas primárias na proteína ELP ao misturar soluções na proporção volumétrica descrita de 4:1 para um hidrogel ELP final de 3% (p/v). A solução THPC é viscosa e gotículas de solução podem grudar na lateral da ponta da pipeta. Para concentrações precisas, evite essas gotículas ao diluir em DPBS. Purgue o recipiente de estoque THPC com gás nitrogênio para evitar a oxidação da fosfina e a inativação do reticulador.
   3. Vortex a solução para misturar e manter no gelo.
   4. Filtrar estéril: a solução de estoque de THPC usando um filtro de seringa de 0,22 μm. Dilua ainda mais a solução estoque de THPC com DPBS estéril para obter taxas de reticulação estequiométricas mais baixas (por exemplo, 0,5:1 ou 0,75:1).
      nota: O THPC é sensível ao oxigênio e a solução diluída deve ser usada dentro de algumas horas após o preparo.
5. Dissocie as células por incubação com tripsina-EDTA em uma suspensão de célula única, pelete as células e conte as células ressuspensas em meio usando um hemocitômetro.
   nota: Os protocolos exatos para esta etapa dependerão muito do tipo de célula e da aplicação desejada. Para as células progenitoras neurais utilizadas ao longo deste protocolo, foi realizada uma incubação de tripsina-EDTA a 0,025% à temperatura ambiente por 1,5 min. As células foram peletizadas a 200 x g por 2 min. Para aumentar a viabilidade celular, as células devem ser suspensas em condições normais de meio. As densidades celulares típicas usadas para encapsulamento celular variam de 1 a 50 x 10,⁶ células/mL de volume final de hidrogel. Ajuste conforme necessário.
6. Alicote o número desejado de células em um tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL.
7. Centrifugue as células a ~ 200 x g por 3 min. Com cuidado, aspire o sobrenadante e mantenha o pellet da célula no gelo.
   nota: É fundamental aspirar completamente todo o sobrenadante para mitigar a diluição adicional do reticulador ELP e THPC. As velocidades específicas de centrifugação variam de acordo com o tipo de célula.
8. Ressuspenda o pellet celular na solução-mãe ELP de modo que o volume seja 80% do volume final (assumindo uma proporção de 4:1 de solução ELP:THPC). Pipetar misturar 20-25 vezes para produzir uma mistura homogênea das células e ELP.
   nota: Evite segurar o fundo do tubo para mitigar o aumento da temperatura e a subsequente transição de fase do ELP. Cada molde de 2 mm com três repetições requer 7,5 μL de volume final (ou seja, 6 μL de solução estoque ELP e 1,5 μL de solução estoque THPC) divididos igualmente nos 3 orifícios (ou seja, 2,5 μL de volume final por orifício). Para os moldes de 4 e 5 mm, é necessário um volume final de 7,5 μL e 15,5 μL, respectivamente.
9. Adicione a solução estoque de THPC à suspensão de célula/ELP para o volume final de 20% restante. Pipete a mistura 20-25 vezes para produzir uma mistura homogênea.
10. Pipetar imediatamente os volumes finais correspondentes da mistura célula/ELP/THPC em cada molde com movimentos circulares. Repita para todos os moldes.
11. Incubar as amostras em temperatura ambiente por 15 min, seguido de uma incubação adicional a 37 °C por 15 min.
    nota: O primeiro período de incubação ajudará a facilitar a reticulação inicial do hidrogel antes de aumentar a temperatura para aquela acima da temperatura crítica mais baixa da solução do ELP (LCST) e induzir sua segregação de fase térmica.
12. Adicione lentamente 750 μL de meio de cultura de células quente a cada poço da placa de 24 poços, evitando romper os géis.
13. Incubar os hidrogéis a 37 °C por 7 dias.
    nota: Recomenda-se a troca completa do meio a cada 1-2 dias, dependendo do tipo de célula. Para limitar o estresse no gel, use uma pipeta Pasteur de vidro afixada com uma ponta de pipeta de 200 μL ao aspirar o meio do poço.

2. Imunocitoquímica de células em hidrogéis 3D ELP

1. Prepare a solução de fixação misturando 10 mL de paraformaldeído (PFA) a 16% (p / v) em 30 mL de DPBS. Aquecer a solução a 37 °C.
2. Aspire o meio da placa de 24 poços e lave suavemente com 1 mL de DPBS.
3. Adicionar 750 μl da solução de fixação a cada alvéolo e incubar a 37 °C durante 30 min. Não use a incubadora de cultura de tecidos para evitar a contaminação de outras culturas com vapor de PFA.
4. Aspire cuidadosamente a solução de fixação de cada poço, descartando o PFA para um recipiente apropriado de resíduos perigosos.
   cuidado: A exposição ao PFA pode causar irritação na pele e nos olhos. Use luvas/óculos de segurança e trabalhe em um exaustor químico.
5. Adicione 1 mL de DPBS a cada amostra. Aspire imediatamente o DPBS e descarte no recipiente de resíduos de PFA.
6. Lave as amostras duas vezes com 1 mL de DPBS por 10 min cada.
   nota: As amostras podem ser armazenadas em DPBS a 4 °C por até uma semana após selar a placa com Parafilm.
7. Permeabilize cada amostra com 750 μL de solução de permeabilização (100 mL de DPBS e 0,25 mL de Triton X-100; PBST) por 1 h em temperatura ambiente em um balancim a 15 rpm.
8. Aspire o PBST e adicione 750 μL de solução de bloqueio (95 mL de PBS, 5 g de albumina de soro bovino (BSA), 5 mL de soro e 0,5 mL de Triton X-100) a cada amostra. Incubar em temperatura ambiente por 3 h em um balancim a 15 rpm.
   nota: A solução de bloqueio deve conter soro da espécie hospedeira na qual os anticorpos secundários foram criados (por exemplo, cabra, burro) e filtrado estéril através de um filtro de 0,22 μm antes do uso.
9. Prepare a solução de diluição de anticorpos (97 mL de DPBS, 2,5 g de BSA, 2,5 mL de soro (da mesma espécie hospedeira a partir da qual o EPL é preparado) e 0,5 mL de Triton X-100). Diluir o anticorpo primário com a solução de diluição de anticorpos e adicionar 500 μl da solução a cada amostra. Sele a placa com Parafilm e incube durante a noite a 4 °C em um balancim.
   nota: Os anticorpos primários Nestin e Sox2 foram diluídos 1:400 em solução de diluição de anticorpos da concentração original dos fabricantes.
10. Aspirar a solução de anticorpos de cada amostra e lavar as amostras com PBST durante 60 minutos à temperatura ambiente num balancim a 15 rpm. Repita a etapa de lavagem 3 vezes.
11. Diluir os anticorpos secundários e 5 mg/ml de DAPI (1:2.000) utilizando a solução de diluição de anticorpos e adicionar 500 μL da solução a cada amostra. Cubra a placa de 24 poços com papel alumínio e incube durante a noite a 4 °C em um balancim.
    nota: Como os anticorpos secundários são sensíveis à luz, as amostras devem ser protegidas do fotobranqueamento em todas as etapas subsequentes. Os anticorpos secundários anti-camundongo e anti-coelho caprino foram diluídos 1:500 em solução de diluição de anticorpos a partir da concentração original do fabricante.
12. Aspire a solução de anticorpos de cada amostra e lave as amostras com PBST por 30 min em temperatura ambiente no balancim. Repita a etapa de lavagem 3 vezes.
13. Posicione uma gota de meio de montagem rígido na superfície de uma lâmina de vidro. Usando uma pinça, remova o excesso de solução do molde enxugando levemente a borda do molde em uma toalha de papel. Coloque cuidadosamente o molde de cabeça para baixo no meio de montagem e evite a introdução de bolhas.
14. Deixe o meio de montagem endurecer por 48 h em temperatura ambiente. Armazene as amostras em temperatura ambiente ou 4 °C. Deixe o meio de montagem endurecer totalmente por 48 h antes da imagem, pois o índice de refração do meio mudará ao longo do endurecimento. Sele as amostras na lâmina da tampa de vidro com esmalte transparente para mitigar a contaminação ou o movimento da amostra.
15. Visualize as amostras usando um microscópio confocal.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Encapsulamento celular em hidrogéis 3D ELP
Filtros de seringa de 0,22 μm	Millipore	SLGV004SL
Folha de silicone de 0,5 mm de espessura	Ciência da Microscopia Eletrônica	70338-05
Placas de cultura de tecidos de 24 poços	Corning	353047
Perfurador de biópsia descartável (2 mm)	Integra Miltex	33-31
Punção de biópsia descartável (4 mm)	Integra Miltex	33-34
Punção de biópsia descartável (5 mm)	Integra Miltex	33-35
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)	Corning	21-031-CM
Nº 1 lamínulas de vidro de 12 mm	Thermo Fisher Científico	12-545-80
Cloreto de tetrakis(hidroximetil)fosfônio (THPC)	Sigma-Aldrich	Rolamento 404861-100ML
0,5% Tryspin/EDTA	Thermo Fisher	15400054
Imunocitoquímica de células em hidrogéis 3D ELP
16% (p/v) de paraformaldeído (PFA)	Ciências da Microscopia Eletrônica	Rolamento 15701
Albumina de soro bovino (BSA)	Roche	3116956001
DAPI (4',6-Diamidino-2-fenilindo, dicloridrato)	Sondas Moleculares	D1306
Soro de Burro	Laboratórios Biológicos Lampire	Rolamento 7332100
Anticorpo secundário anti-rato de cabra (AF488)	Sondas Moleculares	A-11017
Anticorpo secundário anti-coelho de cabra (AF546)	Sondas Moleculares	A-11071
Soro de cabra	Gibco	16210-072
Anticorpo primário Nestin de camundongo	BD Pharmingen	556309
Anticorpo primário Sox2 de camundongo	Tecnologia de sinalização celular	23064S
esmalte	Ciências da Microscopia Eletrônica	Rolamento 72180
Tritão X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Meio de montagem Vectashield Hardset	Laboratórios de vetores	H-1400