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1. Conjugação de Peptídeo de Anticorpo
NOTA: O ácido cólico ligado ao NLS (ChAcNLS) pode ser sintetizado em qualquer fabricante comercial de peptídeos ou plataforma de serviços de síntese de peptídeos afiliada à universidade.
- Em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL, prepare uma solução de 10 mg / mL (~ 1 mg de anticorpo total) de 7G3 em solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,6.
- Dissolver o 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfossuccinimidil (sulfo-SMCC) em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração de 5-10 mM. O vórtice da solução funciona melhor para alcançar a dissolução completa.
- Adicione ao tubo contendo 7G3 a solução dissolvida de enxofre-SMCC (normalmente entre 5-20 μL, dependendo da proporção molar de sulfo-SMCC-para-7G3 desejada). Recomenda-se testar as proporções sulfo-SMCC para 7G3 de 10, 25 e 50 para 1. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
- Purifique e concentre o 7G3 derivado de maleimida usando um dispositivo de ultrafiltração e troca de tampão em PBS, pH 7,0. Centrifugue a 8.000 x g por aproximadamente 5 min. Descarte o fluxo e encha com PBS, pH 7,0 e centrifugue novamente.
- Execute isso 7 a 8 vezes para trocar o buffer completamente. Recupere a proteína 7G3 concentrada colocando o dispositivo de filtro de cabeça para baixo em um tubo de microcentrífuga limpo. Centrifugue por 2 min a 1.000 x g. O volume de recuperação deve ser de aproximadamente 0,3 mL.
- No tubo que contém o 7G3 ativado por maleimida, adicione um excesso molar de 2 vezes de ChAcNLS em relação à relação sulfo-SMCC-para-7G3 usada na etapa anterior e incube durante a noite a 4 ° C. Por exemplo, se uma proporção de 10 para 1 sulfo-SMCC-para-7G3 foi usada, use uma proporção de 20 para 1 ChAcNLS-para-7G3. O volume total não deve ser alterado significativamente.
nota: Embora o ChAcNLS não cause precipitação durante o processo de conjugação, essa é uma possibilidade que pode ocorrer com outros peptídeos. Observe o tubo durante a reação em busca de sinais de precipitação, que provavelmente é causada quando os peptídeos são hidrofóbicos. Nesses casos, pode valer a pena revisitar o peptídeo de interesse para projetar mudanças para fornecer maior hidrofilicidade.
- Concentre o 7G3-ChAcNLS usando um dispositivo de ultrafiltração até a concentração desejada e a troca de tampão em PBS pH 7,4 (consulte a etapa 1.4). O rendimento de recuperação da proteína total deve ser ≥ 75% da matéria-prima original.
- Realize eletroforese em gel de dodecil sulfato-poliacrilamida de sódio (SDS-PAGE) para avaliar os candidatos 7G3-ChAcNLS construídos usando um gel de poliacrilamida a 12% (fornece separação suficiente das cadeias pesadas e leves conjugadas ChAcNLS das cadeias não conjugadas). Misturar 10 μg de 7G3-ChAcNLS em tampão de carregamento PAGE contendo 2 μL de β-mercaptoetanol e carregar no poço.
- Defina a tensão apropriada (120 V por 1 h para um gel de 12%) e execute a eletroforese. Pare a eletroforese quando a frente do corante Coomassie atingir o fundo do gel.
nota: Não deixe a frente do corante Coomassie escorrer do gel.
- Remova o gel do aparelho de eletroforese e enxágue com solução de descoloração contendo 10% v / v de ácido acético glacial e 20% v / v de metanol.
- Tire uma foto do gel e com uma régua e meça a distância (cm) migrada para os padrões e conjugados 7G3. Calcule o valor do fator de retenção (Rf), que é a distância migrada dividida pelo comprimento do gel (de onde a proteína é carregada para a frente de migração de Coomassie). Plotar o peso molecular (MW) em log em relação aos valores de Rf de cada padrão de proteína e extrapolar o tamanho dos conjugados 7G3.
- Calcule o número de peptídeos por anticorpo dividindo a diferença em MW entre conjugados 7G3 e 7G3 não modificado por 1768,5 g/mol (MW de ChAcNLS).
- Tire imagens digitais do gel corado com Coomassie e faça a análise de densitometria. Neste ponto, a seleção de um candidato principal pode ser baseada no AC com o número máximo de moléculas de ChAcNLS que não contém espécies agregadas significativas.
2. Microscopia Confocal para Avaliação de Acumulação Intracelular
NOTA: É importante testar a seletividade celular do acúmulo intracelular dos mAbs modificados por peptídeos antes de desenvolver formulações com uma carga útil de interesse. Como o Tat também demonstrou ter uma propensão à penetração celular inespecífica, vale a pena primeiro analisar o acúmulo intracelular e a seletividade celular antes de realizar etapas de desenvolvimento caras com cargas úteis caras. Por esse motivo, o Procedimento 1 também deve modificar mAbs de controle irrelevantes específicos do isotipo. Para o restante do protocolo, trabalharemos com ACs modificados com 10 moléculas de ChAcNLS por anticorpo. Um esquema incluindo as principais etapas para os Procedimentos 2 e 3 é descrito na Figura 1.
CUIDADO: Esta etapa do protocolo envolve o manuseio e manipulação do paraformaldeído. Por favor, siga as instruções do fabricante ao manusear.
- Trate as células-alvo TF-1a com 200 nM de 7G3-ChAcNLS, incluindo mAbs de controle modificado. Incubar 5 x 106 células positivas para o antígeno com os conjugados por 1 h a 37 °C.
- Após 1 h, remova o sobrenadante e lave com 1 mL 3x em PBS gelado. Adicione meios frescos e incube por mais uma hora a 37 °C.
- Após a hora adicional, remova o sobrenadante e lave 3x em 1 mL de PBS gelado. Adicione 0,5 mL de PBS contendo 0,25% de tripsina e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 37 °C por 3 a 30 min.
nota: Durante o teste piloto inicial, recomenda-se não tripsinizar as células para determinar as diferenças no acúmulo intracelular de CA. Este protocolo promove o uso de tripsina e demonstramos como isso melhora a avaliação da eficiência de acúmulo intracelular de diferentes candidatos a AC.
- Teste os diferentes tempos de incubação verificando visualmente se todas as células estão sendo separadas. Além disso, incubar alíquotas celulares com soluções de coloração de viabilidade e realizar análises de citometria de fluxo conforme descrito anteriormente.
- Neutralize a tripsina com 1,5 mL de mídia de cultura de células RPMI 1640 / soro bovino fetal a 10%. Centrifugue as células a 500 x g por 5 min, remova o sobrenadante e lave 3x em 0,5 mL de PBS gelado.
- Fixe as células em 0,5 mL de PBS contendo 1% de paraformaldeído e 1% de sacarose em gelo por 30 min. Lave as células 3x em 0,5 mL de PBS gelado e centrifugue a 250 x g por 5 min. Permeabilize as células em 0,5 mL de PBS contendo 0,15% de Triton X-100 por 5 min em gelo. Lave as células em PBS gelado e repita a centrifugação.
- Suspenda as células em 0,1 mL de PBS contendo 2 μg/mL (ou a concentração recomendada pelo fabricante) de um anticorpo policlonal secundário Fc antimurino (específico do isotipo) conjugado ao AlexaFluor 647 por 1 h em temperatura ambiente no escuro.
- Centrifugue a 250 x g por 5 min e lave as células 3x em 0,5 mL de PBS gelado. Suspender células em 0,5 mL PBS.
pausa: As células podem ser armazenadas na geladeira.
nota: É essencial selecionar um anticorpo secundário que reconheça o isotipo correto do mAb de interesse. O AF647 é selecionado devido à sua emissão de infravermelho distante, que não interfere na coloração de iodeto de propídio (PI) do núcleo.
- Adicione PI a uma concentração de 10 μg/mL ao recipiente com células. Em seguida, monte 1 x 105 células em lâminas de vidro usando a mídia de montagem e cubra com uma lamínula de vidro.
- Examine as células com uma objetiva de imersão em óleo Plan Apo 60X NA 1.42 em um microscópio confocal de varredura a laser invertido. Detecte a fluorescência PI usando o laser de argônio de 488 nm e o prisma de varredura espectral definido para 600 - 650 nm. Para fluorescência AF647, use o laser de hélio-neônio de 633 nm e o prisma de varredura espectral definido para 650 - 700 nm. Colete as emissões de fluorescência de PI e AF647 sequencialmente.
nota: Use a mesma configuração em toda a avaliação e comparação das células. No entanto, você terá que ajustar as configurações para células tripsinizadas em comparação com células não tripsinizadas.
- Use o software do microscópio para adquirir imagens. Colete imagens usando seções ópticas horizontais seriais de 1.024 x 1.024 pixels com média de linha 2X tirada em intervalos de 0,5 μm em toda a espessura da célula. Apresente as imagens como projeções z empilhadas de quatro fatias consecutivas na intensidade máxima de fluorescência.
- Analise células com software de microscópio. Registre o padrão de distribuição celular dos conjugados. Especificamente, avalie se a fluorescência intracelular no citoplasma está agrupada e próxima à superfície celular ou difusa e homogênea. Avalie também a intensidade relativa de fluorescência por célula.
