Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação do cateter antes da cirurgia estereotáxica
- Corte os cateteres PE50 (6 cm de comprimento) que serão usados para conectar a cânula com bombas osmóticas (ver Figura 1). Encha os cateteres PE50 com líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) e sele ambas as extremidades dos cateteres. Mantenha o cateter a 4 °C até ser usado.
2. Implante de cânula por estereotaxia
- Realize a cirurgia em condições estéreis. Esterilize todos os instrumentos e materiais cirúrgicos em autoclavagem. Limpe bem o aparelho estereotáxico e a área de trabalho e desinfete com uma solução de etanol a 70%. Use uma máscara cirúrgica, gorro de cabelo e luvas estéreis.
- Anestesiar ratos injetando intraperitonealmente (i.p.) uma solução de cetamina e xilazina (100 mg/kg e 10 mg/kg, respectivamente). Confirme a anestesia verificando o movimento após um leve beliscão do dedo do pé.
- Injete um anti-inflamatório não esteróide (Meloxicam; 1 mg / kg) por via subcutânea (s.c.) no animal anestesiado pelo menos 30 minutos antes da cirurgia.
- Raspe a cabeça do animal com uma tesoura e desinfete a pele três vezes com uma solução de gluconato de clorexidina 2% e álcool isopropílico 2%. Aplique pomada oftálmica veterinária nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
- Coloque o animal em uma estrutura estereotáxica com as barras auriculares. Fixe uma cânula no braço suporte da estrutura estereotáxica. Injete (s.c.) um agente anestésico local (bupivacaína (1,5 mg/kg) e lidocaína (1,5 mg/kg) no topo da cabeça. A anestesia é mantida durante todo o procedimento, colocando-se um cone nasal que fornece isoflurano a 3%. Todo o campo cirúrgico deve ser delimitado, mas isso não foi feito aqui para demonstrar melhor a técnica.
- Faça uma incisão de 3 cm no topo da cabeça com um bisturi. Instale 4 grampos ao redor da incisão para deixar o crânio limpo. Usando uma tesoura de ponta redonda, faça um bolso (2 x 2 cm2) sob a pele entre as omoplatas do animal.
- Raspe o periósteo do crânio com uma lâmina. Aplique uma gaze no crânio se estiver sangrando.
- Verifique se o crânio está plano e bem alinhado na estrutura estereotáxica. Para garantir que o crânio seja plano, verifique as coordenadas de altura no bregma e lambda. Pegue as coordenadas bregma que serão usadas como ponto de referência.
- A partir do bregma, calcule as coordenadas das duas cânulas guia que serão implantadas bilateralmente no hipocampo (ântero-posterior: - 0,42 cm; mediolateral: ± 0,30 cm; dorsoventral: - 0,28 cm de acordo com o atlas cerebral de ratos Paxinos e Watson). Indique a posição da cânula com um marcador.
- Faça um furo (0,5 mm) no crânio no ponto de implantação de ambas as cânulas. Faça dois outros furos aproximadamente 5 mm acima e abaixo desses pontos para inserir parafusos que solidificarão a cânula ao aplicar cimento dentário.
- Corte uma extremidade do cateter previamente preenchido com aCSF com um bisturi e insira-o no braço angular da cânula. Fixe a primeira cânula com cimento dentário. Evite colocar cimento dental ao redor da posição na segunda cânula.
- Deixe o cimento dental secar por 2 a 3 min, depois remova o braço de suporte da primeira cânula e fixe a segunda cânula nele. Repita as etapas 2.11 e 2.12. Coloque uma cânula fictícia em ambas as cânulas guia. Certifique-se de que o manequim e a cânula guia tenham o mesmo comprimento para evitar a infiltração do tecido e o bloqueio da cânula.
- Insira a extremidade livre de ambos os cateteres no bolso previamente feito entre as omoplatas do animal. Retire as pinças e costure a pele com fio de sutura 4-0.
nota: A cânula guia superior deve estar acessível para as próximas infusões de Aβo.
- Remova o animal da estrutura estereotáxica e coloque-o de volta em sua gaiola. Durante a recuperação pós-cirúrgica, coloque a gaiola sobre um cobertor de água para aquecimento até que o animal acorde. A gaiola deve estar parcialmente na almofada para que o rato possa escapar do calor, se necessário. Monitore o animal constantemente até que ele recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
- Devolva os ratos ao biotério para se recuperarem da cirurgia por 10 dias sob monitoramento rigoroso.
nota: Não devolva um animal que tenha sido submetido a cirurgia à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. O meloxicam (1 mg/kg) é administrado uma vez por dia durante dois dias após a cirurgia para tratar a dor.
3. Instalação da bomba osmótica
- Um dia antes da instalação, encha as bombas osmóticas com anticorpo 6E10 (1 mg/ml; 100 μl) e anticorpo IgG1 de controle (1 mg/ml; 100 μl) de acordo com as instruções do fabricante em condições estéreis. Mantenha as bombas em água destilada estéril a 37 °C durante a noite para ativar as bombas.
- Anestesiar ratos com isoflurano 3% para instalar bombas osmóticas (0,5 μl/h por 7 dias). Faça a barba entre as omoplatas e desinfete a pele com uma solução de gluconato de clorexidina 2% e álcool isopropílico 2%. Faça uma incisão de 2 cm com bisturi entre as omoplatas para localizar os cateteres PE50 conectados à cânula guia.
- Corte a extremidade dos cateteres PE50 contendo cimento dentário com um bisturi. Conecte as bombas osmóticas aos cateteres PE50 e adicione um pouco de cimento dental na junção da bomba e do cateter para garantir a conexão.
- Costure a pele firmemente com um fio de sutura 4-0. Coloque o animal de volta em sua gaiola em uma almofada de água para aquecimento. Observe o animal acordar rapidamente de uma anestesia com isoflurano (cerca de 5 min).
nota: A cirurgia leva aproximadamente 5 a 10 minutos.
4. Infusões de Aβo em ratos acordados e em movimento livre
- Preparar a solução de Aβo (0,2 μg/μl). Deixe Aβo agregar-se dinâmica e espontaneamente por 1 hora à temperatura ambiente antes da infusão.
- Instale duas seringas de 10 μl em uma bomba de infusão. Encha as seringas com 5 μl de água destilada estéril. Corte dois cateteres PE50 com cerca de 60 cm de comprimento com um bisturi. Encha ambos os cateteres com água destilada estéril usando seringas de 1 ml e agulhas 21G.
- Mantenha as seringas de 1 ml em uma extremidade do cateter e conecte a outra extremidade às seringas Hamilton. Remova as seringas de 1 ml e verifique se não há bolhas de ar dentro dos cateteres.
- Insira a cânula interna na extremidade dos cateteres PE50. Usando água destilada estéril, encha a cânula interna conectada aos cateteres PE50 até 1 μl nas seringas Hamilton. Faça uma bolha de ar puxando os pistões para trás até 2 μl.
- Misturar a solução de Aβo pipetando para cima e para baixo com uma ponta de aderência mínima. Evite formar bolhas durante a mistura. Encha ambas as cânulas internas com 1,5 μl de solução de Aβo puxando os pistões para trás até 3,5 μl.
- Faça linhas com um marcador antes e depois da bolha de ar em ambos os cateteres. Isso serve como um ponto de verificação para a infusão contínua. Para perfusão, aproxime a gaiola da bomba de perfusão e retire a tampa.
- Coloque o rato em um aconchego e raspe firmemente o braço do aconchego em volta do pescoço para imobilizar a cabeça do rato. Remova a cânula fictícia das duas cânulas guia. Insira a cânula interna previamente preparada na cânula guia. Verifique se eles estão totalmente inseridos e bem fixados na base da cânula guia.
- Solte o rato do aconchego e coloque-o de volta em sua gaiola para limitar o estresse de contenção. Monitore de perto para garantir que os cateteres não se torçam e que a infusão seja feita corretamente.
- Ligue a bomba de perfusão. Injete 1 μl de solução de Aβo a uma taxa de 0,1 μl/min (10 min). Durante a perfusão, verifique se o pistão da seringa se move de 3,5 μl para 2,5 μl e se a bolha de ar em ambos os cateteres PE50 se move continuamente.
- Deixe a cânula interna no lugar por mais 5 minutos após a infusão para permitir a difusão eficiente da solução de Aβo. Traga o rato de volta ao aconchego para remover a cânula interna e a cânula guia tampada para evitar o refluxo da solução injetada. Use uma cânula fictícia que pare logo antes do braço angular da cânula. Devolva o animal à sua gaiola.
- Repita a infusão de Aβo uma vez por dia durante 6 dias consecutivos. Eutanásia do animal por decapitação.
