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1. Fabricação e funcionalização de imunossondas capacitivas
- Corte um comprimento de 25 cm de fio de platina revestido com perfluoroalcoxi (PFA) (consulte a Tabela de Materiais) e retire aproximadamente 5 mm de revestimento de PFA de uma extremidade usando um bisturi, tomando cuidado para não cortar o fio de platina.
- Insira a extremidade desencapada do fio de platina em um pino de conector macho de 1 mm banhado a ouro e prenda os dentes do pino do conector ao redor da extremidade desencapada do fio de platina usando um alicate de ponta fina (consulte a Tabela de Materiais).
- Solde o fio de platina ao pino do conector banhado a ouro. Tenha cuidado para não usar uma quantidade excessiva de solda.
- Prepare a solução de dopamina dissolvendo 50 mg de dopamina HCl em 50 mL de solução salina tamponada com fosfato 10 mM (PBS, pH 6,0) agitando.
- Assim que a dopamina estiver completamente dissolvida, coloque a ponta do fio de platina no recipiente que contém o PBS suplementado com dopamina recém-produzido. Conecte um pino conector dourado em um canal do headstage (consulte a Tabela de Materiais).
- Conecte o eletrodo do disco de cloreto de prata (AgCl) (eletrodo de aterramento, consulte a Tabela de Materiais) ao canal de aterramento no headstage. Coloque o disco de AgCl no recipiente contendo PBS suplementado com dopamina e fio de platina; Tenha cuidado para submergir apenas o eletrodo do disco e não qualquer comprimento do fio ou solda. Conecte um shunt de fio nos canais de referência do headstage antes de prosseguir.
- Abra o software interativo de aquisição de dados (consulte Tabela de materiais). Prepare um protocolo de potencial de comando de eletrodeposição dente de serra com os seguintes parâmetros: potencial inicial = −0,6 V; potencial final = +0,65 V; taxa de varredura = 0,04 V∙s-1; Duração da deposição = 420 s. Inicie o protocolo de deposição de polidopamina, garantindo que todos os fios estejam conectados corretamente.
- Depois de completar a deposição de polidopamina, remova o grânulo de aterramento de AgCl e a ponta do fio de platina do recipiente, tomando cuidado para não perturbar a ponta do eletrodo de fio de platina. Coloque a ponta do fio em um microtubo contendo PBS (pH 7,4) por 2-5 min enquanto a solução de anticorpos é preparada; Certifique-se de que a ponta do fio não entre em contato com as laterais ou a parte inferior do microtubo.
NOTA: A solução de anticorpos pode ser feita durante a deposição de polidopamina; no entanto, a transferência do fio de platina do vaso contendo dopamina para o microtubo de PBS após a deposição de polidopamina não deve ser ignorada.
- Preparar a solução de anticorpos. Combine o anticorpo de interesse com PBS (pH 7.4) na proporção de 1:20 em um vaso de tamanho apropriado (por exemplo, um microtubo).
NOTA: O anticorpo monoclonal anti-neuropeptídeo Y (anti-NPY) (ver Tabela de Materiais) usado aqui foi aliquotado a 1 mg / mL; um exemplo de preparação de anticorpos aqui seria 4 μL de anticorpo para 76 μL de PBS.
- Mergulhe a ponta depositada em polidopamina do eletrodo de platina em solução de anticorpo por um mínimo de 2 h em temperatura ambiente, novamente garantindo que a ponta do fio de platina esteja suspensa em solução e não apoiada na superfície interna do microtubo.
NOTA: A implementação recente desta técnica favoreceu o uso do eletrodo de fio de platina imediatamente após esta etapa, em vez do armazenamento úmido ou seco para uso posterior.
- Após imersão na solução de anticorpos, enxágue brevemente a ponta da imunossonda capacitiva (sonda CI) recém-funcionalizada em PBS (pH 7,4). A sonda agora está pronta para uso.
2. Configuração experimental para detecção in vitro e medição de peptídeos
- Coloque a ponta funcional da sonda CI na câmara de fluxo, tomando cuidado para não perturbar a ponta do eletrodo de forma alguma, pois isso pode danificar a ponta sensorial da sonda.
NOTA: A câmara de fluxo foi criada despejando elastômero de silicone (consulte a Tabela de Materiais) em uma placa de cultura de 35 mm com um preenchimento de espaço ovóide alongado no centro da placa. Após o endurecimento, a forma ovóide é removida do elastômero. A câmara é então superfundida com solução salina tamponada com Tris (TBS) e permite uma taxa de fluxo de 3 mL / min. Certifique-se de que a entrada e a saída mantenham o nível do fluido na câmara de modo que nenhuma ação de maré do superfusato seja observada. O fluxo deve permanecer no local enquanto a sonda de CI estiver em uso.
- Antes do primeiro teste experimental, execute uma execução padrão TBS para condicionar a sonda CI. Configure o seguinte comando voltage protocolo: potencial de passo positivo = +100 mV; potencial de passo negativo = −5 mV; duração do passo = 20 ms; Duração da aquisição = 600 s.
NOTA: É importante permitir o equilíbrio da sonda durante a fase inicial do ciclo do potencial de comando antes da aquisição de dados.
- Crie uma solução do peptídeo de interesse usando o mesmo TBS para manter a composição do superfusato. Configure um sistema coletor onde o superfusato possa ser alternado entre TBS e TBS suplementado com peptídeos sem introduzir bolhas no sistema de tubulação ou na câmara de fluxo.
NOTA: O peptídeo NPY suíno sintético (ver Tabela de Materiais) foi usado no presente estudo.
- Configure o protocolo de aquisição de dados de detecção de peptídeos usando parâmetros padrão TBS (consulte a etapa 2.2.).
NOTA: Nesta implementação, a duração de cada teste experimental foi de 360 s (120 s TBS, 120 s TBS suplementado com peptídeo, 120 s TBS).