1. Preparação antes da rotulagem
- Preparação e manutenção de culturas primárias do hipocampo
- Preparar culturas primárias do hipocampo a uma densidade de 150.000 células semeadas em vidro de cobertura de 18 mm revestido com poli-D-lisina (0,1 mg/ml). Excelentes guias para preparação de cultura neuronal dissociada estão disponíveis.
nota: Se necessário, as culturas podem ser tratadas com citosina arabinosídeo (Ara-C, 10 μM a partir de dias in vitro 1 [DIV1]) para evitar a proliferação glial na preparação.
nota: Reagentes de revestimento alternativos, como fibronectina (1 mg/mL) ou laminina (5 μg/mL), podem ser usados em vez de poli-D-lisina.
- Manter culturas em incubadora celular a 37 °C e 5% de CO2 em 2 mL/poço de meio neurobasal suplementado com B27 e 2 mM de L-glutamina.
nota: Substitutos da L-glutamina (por exemplo, Glutamax) podem ser usados, se desejado.
- Semanalmente, remova metade do volume do meio e substitua pelo mesmo volume do meio neurobasal suplementado.
- OPCIONAL: Transfecção de receptores mutados e/ou marcados com epítopos
NOTA: Os neurônios devem ser transfectados pelo menos 3 a 4 dias antes do ponto de tempo da análise para permitir a expressão do receptor. O uso de neurônios jovens (DIV6-9) resulta em melhor eficiência de transfecção do que os neurônios mais velhos (DIV15-20), mas um número suficiente de células transfectadas (>20) pode ser alcançado independentemente do DIV empregado.
- Para cada poço de uma placa de 12 poços, diluir 1,5 μg de plasmídeo contendo a construção de interesse em 100 μL de meio neurobasal fresco sem suplementação de B27 ou glutamina em um tubo de microcentrífuga e misturar por vórtice rapidamente.
nota: Para uma transfecção bem-sucedida, é fundamental que o meio neurobasal usado seja o mais fresco possível, idealmente menos de 1 semana após a abertura do frasco.
- Em um segundo tubo de microcentrífuga, misture 1 μL de um reagente de lipofecção apropriado em 100 μL de meio neurobasal fresco e misture suavemente.
nota: Não vórtex a mistura de reagentes de lipofecção. O uso de reagentes de lipofecção frescos pode melhorar a eficiência da transfecção.
- Incube os tubos por 5 min em temperatura ambiente (RT).
- Adicione a mistura de reagentes de lipofecção gota a gota à mistura de DNA, misture delicadamente e incube por 20 min em RT.
- Ajuste o volume do meio em cada poço para 1 mL de meio condicionado.
- Adicione a mistura de reagente de lipofecção - DNA gota a gota ao poço.
- Devolva as células à incubadora e aguarde pelo menos 3 a 4 dias para a expressão da proteína.
nota: Para os propósitos dos protocolos de internalização e reciclagem descritos abaixo, os neurônios do hipocampo foram transfectados em DIV11-12 com construções expressando GluN2B marcadas com proteína fluorescente verde (GFP) no domínio extracelular (GFP-GluN2B) e fotografadas em DIV15-16.
- OPCIONAL: Incubação das células com fármacos (crônica ou agudamente) no meio condicionado até a fixação.
NOTA: Para tratamento agudo, comece a tratar as células antes de rotular. Dependendo do protocolo de tratamento medicamentoso usado, as células podem ser mantidas em meios contendo medicamentos durante a seção 2. Em nosso exemplo, as células DIV21 foram submetidas a um protocolo de potenciação de longo prazo induzido quimicamente (cLTP) para aumentar o receptor de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiônico expresso na superfície (AMPAR).
- Trocar meios condicionados por solução extracelular (ECS).
- Trate as células com 300 μM de glicina no ECS por 3 min em RT. Como controle, trate uma lamínula irmã com ECS (sem glicina).
- Lave as células 3x com ECS a 37 °C e devolva as células em ECS (sem glicina) à incubadora de células por 20 min antes de continuar com a seção 2.
NOTA: ECS (em mM): 150 NaCl, 2 CaCl2, 5 KCl, 10 ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES), 30 Glicose, 0,001 tetrodotoxina (TTX), 0,01 estricnina e 0,03 picrotoxina em pH 7,4.
2. Marcação ao vivo de receptores expressos na superfície
- Prepare lamínulas para rotulagem
- Para economizar reagentes e facilitar a manipulação, transfira as lamínulas do lado da célula para uma bandeja coberta com filme de parafina.
NOTA: É fundamental nunca deixar as amostras secarem.
- Guarde e mantenha o meio condicionado a 37 °C para as etapas de incubação e lavagem.
nota: Para uma lamínula de 18 mm, recomenda-se a incubação com 75 a 100 μL de meio para marcação de anticorpos e 120 a 150 μL para internalização/reciclagem.
- Marcação de receptores de superfície com anticorpo primário
- Incubar células com anticorpo primário diluído em meio condicionado por 15 min em RT.
nota: Para receptores marcados com GFP, foi utilizado anticorpo anti-GFP de coelho na diluição de 1:1000. Para GluA1 endógeno, foi utilizado anti-GluA1 de camundongo na diluição de 1:200.
- Aspire cuidadosamente o meio contendo anticorpos usando uma pipeta a vácuo e lave as células três vezes com meio condicionado.
nota: Se o meio condicionado não estiver disponível, todas as etapas de lavagem podem ser realizadas usando PBS+ [solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 1 mM MgCl2 e 0,1 mM CaCl2]. A aspiração manual usando uma micropipeta pode ser realizada se a aspiração suave a vácuo não estiver disponível.
3. Expressão de superfície (Figura 1)
- Marcação secundária de anticorpos de receptores expressos na superfície
- Lave uma vez com PBS+.
- Fixe as células incubando com paraformaldeído (PFA) a 4% e sacarose a 4% em PBS por 7 a 8 min.
nota: Ao contrário de outros métodos de fixação, como a incubação de metanol, o PFA não permeia a membrana plasmática e, portanto, é adequado para análise de expressão de superfície. Para obter os melhores resultados, use PFA recém-preparado. O armazenamento de curto prazo de PFA a 4 °C ou de longo prazo (até 30 dias) a -20 °C é permissivo para fixação adequada.
cuidado: O PFA é um conhecido agente cancerígeno. Use equipamento de proteção individual adequado e um capuz de segurança ao manusear.
- Lave as células três vezes com PBS.
regular
nota: Alternativamente, a glicina 0,1 M pode ser usada para lavar o PFA em vez do PBS, pois a glicina extinguirá qualquer fixador restante que possa aumentar o fundo na preparação.
- Bloqueie os locais de ligação inespecíficos incubando com 10% de soro de cabra normal (NGS) em PBS por 30 min em RT.
nota: O tempo de bloqueio pode ser estendido sem efeitos adversos na rotulagem.
- Incubar com anticorpo secundário marcado com fluorescência diluído em 3% de NGS em PBS por 1 h em RT para marcar receptores marcados com anticorpos primários (ou seja, expressos na superfície).
nota: Nestes exemplos, foi usada uma diluição de 1:500 de anticorpos secundários conjugados com Alexa 555: anti-coelho de cabra para receptores marcados com GFP e anti-camundongo de cabra para GluA1.
- Lave as células com PBS 3x.
- Marcação de receptores intracelulares
- Permeabilize as células com 0,25% de Triton X-100 em PBS por 5 a 10 min em RT.
nota: Para verificar se a rodada inicial de marcação de anticorpos ocupa todos os epítopos de superfície, essa etapa de permeabilização pode ser ignorada em uma cultura irmã. Nesse caso, nenhum sinal para receptores intracelulares deve ser obtido. Além disso, para verificar se nenhum receptor interno foi marcado na seção 2 anterior (ou seja, mostrando a integridade das membranas plasmáticas na cultura), a etapa de permeabilização pode ser ignorada em uma cultura irmã, e um anticorpo primário contra uma proteína intracelular (por exemplo, proteína de densidade pós-sináptica 95 [PSD-95] ou proteína 2 associada a microtúbulos [MAP2]) pode ser utilizado na etapa 2.2.1. Nenhum sinal deve ser obtido deste primário nessas condições. Neste caso, um anticorpo anti-PSD-95 de coelho (1:500) foi usado.
- Bloqueio com 10% de NGS em PBS por 30 min em RT.
- Marcar receptores intracelulares incubando células permeabilizadas com o mesmo anticorpo primário usado na seção 2.2 diluído em 3% NGS em PBS por 1 h em RT.
nota: A diluição do anticorpo para marcar receptores intracelulares pode ser diferente daquela necessária para marcar receptores expressos na superfície. No exemplo de GluA1, a mesma diluição de anticorpos (1:200) foi usada.
- Lave as células 3x com PBS.
- Marcação com segundo anticorpo secundário marcado com fluorescência diluído em 3% de NGS em PBS por 1 h em RT.
nota: Nestes exemplos, foi usada uma diluição de 1:500 de anticorpo secundário conjugado com Alexa 647 de cabra anti-camundongo (para GluA1).
- Lave as células 3x com PBS.
4. Internalização (Figura 2)
- Internalização de receptores de superfície marcados com anticorpos
- Após a marcação dos receptores expressos na superfície e lavagem de anticorpos (seção 2.2), mantenha as células em meio condicionado sem anticorpos e devolva-as à incubadora (37 °C) para permitir a internalização.
NOTA: Para receptores N-metil-D-aspartato (NMDA), recomenda-se 30 min para internalização. Como controle, uma cultura irmã pode ser mantida com meio condicionado a 4 °C durante o processo de internalização. A internalização mínima do receptor deve ocorrer nessas condições.
- Marcação de receptores de superfície
- Lave as células uma vez com PBS+.
- Fixe as células com 4% de PFA e 4% de sacarose em PBS por 7–8 min.
cuidado: Use equipamento de proteção individual adequado e um capuz de segurança ao manusear o PFA.
- Lave as células 3x com PBS normal.
- Bloquear com 10% de NGS em PBS por 30 min em RT para evitar ligação inespecífica.
- Incubar amostras com anticorpo secundário marcado com fluorescência diluído em 3% de NGS em PBS por 1 h em RT para marcar receptores marcados com anticorpos primários (ou seja, receptores expressos na superfície que não foram internalizados).
nota: Para este exemplo, o anticorpo secundário anti-coelho de cabra conjugado com Alexa 555 (1:500) foi usado para rotulagem.
- Lave as células 3x com PBS.
- Marcação de receptores internalizados
- Permeabilize as células com 0,25% de Triton X-100 em PBS por 5 a 10 min.
- Bloqueie a ligação inespecífica por incubação com 10% de NGS em PBS por 30 min em RT.
- Incube amostras com anticorpo secundário marcado com fluorescência diluído em 3% de NGS em PBS por 1 h em RT para marcar receptores marcados com anticorpos internalizados.
nota: Para este exemplo, o anticorpo secundário anti-coelho de cabra conjugado com Alexa 647 (1:500) é usado para rotulagem.
- Lave as células 3x com PBS.
5. Reciclagem (Figura 3)
- Internalização de receptores de superfície marcados com anticorpos
- Após a marcação dos receptores expressos na superfície e lavagem de anticorpos (seção 2.2), mantenha as células em meio condicionado sem anticorpos e devolva-as à incubadora (37 °C) para permitir a internalização.
NOTA: Para receptores NMDA, recomenda-se 30 min para internalização.
- Bloqueio de receptores expressos de superfície estáveis
- Para bloquear os epítopos no anticorpo primário ligado a receptores expressos na superfície que não foram internalizados, incube as células com fragmentos de anticorpos Fab anti-IgG (H + L) não conjugados (contra o primário usado na seção 2.2) diluídos em meio condicionado (20 μg / mL) por 20 min em RT. Esse tratamento evita a interação futura com anticorpos secundários.
nota: Para este exemplo, foram utilizados fragmentos de Fab anti-coelho de cabra.
nota: Experiência de controlo: para garantir que ocorreu o bloqueio completo dos recetores expressos na superfície, lamínulas irmãs podem ser incubadas com e sem Fab. As culturas devem ser fixadas imediatamente após o tratamento com Fab, e ambas as culturas são incubadas com anticorpo secundário conjugado com Alexa 555. Nenhum sinal Alexa 555 nas células incubadas por Fab indica bloqueio adequado de anticorpos.
- Lave as células 3x com meios condicionados.
- Incubar células com meios condicionados contendo 80 μM de dynasore para evitar maior internalização e retornar as células à incubadora (37 ° C) para permitir a reciclagem de receptores internalizados. A dynasore é um inibidor da GTPase que inibe a dinamina e, portanto, impede a internalização.
NOTA: Recomenda-se 45 min para reciclagem NMDAR. Observe que o Dynasore bloqueia exclusivamente o processo de internalização dependente de dinamina (por exemplo, internalização de NMDARs). No entanto, a internalização de outras proteínas sinápticas (independente de dinamina) ainda pode ocorrer na presença de Dynasore.
- Marcação de receptores reciclados
- Lave as células uma vez com PBS+.
- Fixe as células com 4% de PFA e 4% de sacarose em PBS por 7–8 min.
cuidado: Use equipamento de proteção individual adequado e um capuz de segurança ao manusear o PFA.
- Lave as células 3x com PBS.
- Bloquear com 10% de NGS em PBS por 30 min em RT para evitar ligação inespecífica.
- Células de marcação com o primeiro anticorpo secundário marcado com fluorescência diluído em 3% de NGS em PBS por 1 h em RT.
nota: Para este exemplo, o anticorpo anti-coelho de cabra conjugado com Alexa 555 (1:500) foi usado para rotulagem.
- Lave as células 3x com PBS.
nota: Lavagens mais longas com PBS (5 a 10 min) podem ajudar a reduzir o fundo na preparação.
- Marcação de receptores internalizados
- Permeabilize as células com 0,25% de Triton X-100 em PBS por 5 a 10 min.
- Bloqueio com 10% de NGS em PBS por 30 min em RT.
- Marcação com segundo anticorpo secundário marcado com fluorescência diluído em 3% de NGS em PBS por 1 h em RT.
nota: Para este exemplo, o anticorpo anti-coelho de cabra conjugado com Alexa 647 (1:500) foi usado para rotulagem.
- Lave as células 3x com PBS.
6. Montagem e imagem de amostras
- Monte as células colocando cuidadosamente as lamínulas voltadas para baixo em 12–15 μL da mídia de montagem apropriada.
nota: A aspiração de mídia de montagem em excesso melhorará a qualidade das imagens.
- Células de imagem em microscópio confocal apropriado.
nota: Recomenda-se obter imagens de uma pilha z com ampliação de 60x com passos de 0,35 μm, abrangendo toda a espessura do neurônio.
7. Considerações de tempo
- Este é um protocolo longo que pode ser interrompido em vários pontos. Se desejar, execute as etapas de bloqueio e incubação primária de anticorpos durante a noite a 4 ° C em uma câmara úmida.
- Como alternativa, se desejar, use um processador de tecidos de micro-ondas para acelerar muito os tempos de incubação pós-fixação. Para todas as etapas, use 150 W a 30 °C para as configurações "On".
- Para bloquear, execute o processador em 2 minutos "Ligado", 1 minuto "Desligado" e 2 minutos "Ligado".
- Para as etapas de incubação de anticorpos primários e secundários, execute o processador em 3 min "On", 2 min "Off" e 3 min "On
NOTA: Não observamos nenhuma diferença na qualidade ao fazer as alterações acima no protocolo.
8. Análise de imagem
- Recomenda-se usar o FIJI para realizar análises de imagens, pois é compatível com vários formatos de arquivo. Para nossos dados, foram adquiridas imagens no formato de arquivo Nikon ND2.
- Um script de macro é fornecido para facilitar a quantificação em lote de diferentes parâmetros pré-selecionados pela FIJI. As etapas a seguir estão incluídas na macro:
NOTA: Para esses exemplos, a "intensidade integrada" foi medida.
- Abra os arquivos de imagem em FIJI e canais separados.
- Projete cada pilha de canais como uma projeção de intensidade máxima.
- Defina um limite inferior para cada canal.
NOTA: Os limites devem ser determinados empiricamente para cada conjunto de dados experimentais. Embora cada canal possa ter um valor de limite inferior separado, é crucial que os valores de limite do canal sejam mantidos de forma consistente para todas as imagens do mesmo conjunto de dados.
- Selecione de três a cinco dendritos secundários ou terciários e salve-os como regiões de interesse (ROIs).
- Meça a densidade integrada de cada ROI em canais de superfície e intracelulares.
- Normalize o sinal para cada ROI dividindo o valor de densidade integrado do canal de superfície pelo canal intracelular.
- Repita as medições para todas as imagens de controle e experimentais e normalize os valores experimentais para valores de controle (por exemplo, GluN2B WT ou condições sem glicina).
