Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparação da microesfera alvo
- Selecione um antígeno alvo relevante.
nota: Neste exemplo, foi usada a proteína recombinante V1V2-2F5K, que foi projetada para imitar o ápice trimérico do envelope nativo do HIV.
- Realize a biotinilação usando um kit comercial (Tabela de Materiais) de acordo com o protocolo do fabricante.
- Calcule o mmol do reagente de biotina para adicionar à reação para um excesso molar de 5 vezes usando a fórmula: mmol biotina = mL de proteína x (mg de proteína/mL de proteína) x (mmol de biotina/mg de proteína) x (5 mmol de biotina/mmol de proteína). Em seguida, calcule μL do reagente de biotina para adicionar usando a fórmula: μL de biotina = mmol de biotina x (1.000.000 μL/L) x (L/10 mmol).
- Equilibre a biotina à temperatura ambiente antes de abrir. Dissolva a proteína em 0,5−2,0 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) de acordo com o cálculo feito acima.
- Preparar uma solução 10 mM de reagente de biotina em dimetilsulfóxido (DMSO) e adicionar o volume adequado de reagente de biotina 10 mM à solução proteica e incubar a reação em gelo durante 2 h ou à temperatura ambiente durante 30 min.
- Remova o excesso de biotina usando concentradores de proteínas (membranas de polietersulfona [PES], corte de peso molecular de 3 kDa [MWCO], 0,5 mL; Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
- Deposite a amostra na câmara superior da coluna de rotação e adicione PBS até 400 μL. Cap, em seguida, insira esta câmara de amostra em um tubo de coleta. Centrifugue a 12.000 x g em temperatura ambiente por 30 min.
- Descarte o fluxo e adicione PBS a 400 μL. Repita a centrifugação. Descarte o fluxo e adicione PBS a 100 μL. Meça a concentração de proteína por um espectrofotômetro.
nota: A proteína pode ser aliquotada e congelada a -80 °C até ser usada.
2. Preparação da placa de ensaio de fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP)
- Proteína biotinilada conjugada a microesferas de 1 μm ('esferas'; Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
- Por placa de esferas conjugadas, incubar 6 μg de proteína com 12 μL de esferas de estoque em 200 μL de albumina de soro bovino a 0,1% (BSA)-PBS em temperatura ambiente por 1 h, agitando suavemente a cada 20 min.
- Centrifugue a 13.000 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante, vortex suavemente e ressuspenda em 1200 μL de BSA-PBS a 0,1%. Repita a etapa de centrifugação e lavagem 2x. Ressuspender em 1200 μL de BSA-PBS a 0,1%.
- Alíquota de 10 μL de solução de grânulos por alvéolo numa placa de fundo redondo de 96 poços. Preparar diluições de anticorpos ou soros imunológicos de interesse em 12 μL de HBSS HSA a 2%, normalmente começando com 50 μg/mL de anticorpo ou uma diluição de soro de 1/100.
nota: Nos dados da amostra, foi utilizado o anticorpo monoclonal (mAb) 830A.
- Adicione 10 μL de anticorpo/soro titulado à placa de esferas e incube por 2 h a 37 °C. Adicione 200 μL de HSA HBSS a 2% a cada poço e centrifugue a placa a 2.000 x g por 10 min.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante por meio de uma rápida viragem e decantação do líquido dos poços da placa para uma pia para evitar perturbar o pellet de grânulo invisível.
3. Isolamento de células do leite materno
- Obtenha leite materno humano de mulheres lactantes saudáveis, extraído usando bombas eletrônicas ou manuais duplas. Isole as células dentro de ~ 4 h de extração, mantendo o leite em temperatura ambiente.
- Usando tubos de 50 mL, centrifugue 50 mL de leite a 800 x g por 15 min. Despeje cuidadosamente o leite desnatado e a gordura, deixando o pellet celular intacto. Limpe o interior do tubo com um pano sem fiapos para remover toda a gordura da parede do tubo.
- Adicione 10 mL de albumina sérica humana a 2% na solução salina balanceada de Hank (HSA HBSS a 2% [sem Ca2+ ou Mg+]). Ressuspenda o pellet pipetando suavemente para evitar a ativação celular e a apoptose. Transfira para um tubo de 15 mL e centrifugue a 450 x g por 10 min.
- Despeje o sobrenadante e repita a etapa 1.3. Em seguida, ressuspenda suavemente as células em 1−2 mL de HSA HBSS a 2%, dependendo do número de células esperado, e conte as células por um hemocitômetro ou um contador de células automatizado, observando também a viabilidade celular.
4. Ensaio ADCP
NOTA: Os métodos descritos aqui são adaptados de Ackerman et al.
- Adicione 50.000 células BM recém-isoladas a cada placa de ensaio ADCP em 200 μL de 2% HSA-HBSS. Incubar durante 2 h a 37 °C.
- Para experimentos de controle, pré-incubar células a 37 ° C com 10 μg / mL de inibidor de actina (citocalasina-D), 50 μg / mL de agente bloqueador do receptor Fc (FcBlock) ou uma combinação de ambos antes de sua adição às placas.
- Placa centrífuga a 930 x g por 10 min. Adicione 200 μL de 2% HSA HBSS e repita a centrifugação. Remova cuidadosamente o sobrenadante como na etapa 2.7 e repita a lavagem.
- Remova cuidadosamente as células sobrenadantes e corantes quanto à viabilidade usando 0,5 μg/mL (concentração final) corante de viabilidade fixável 450 por poço em 50 μL de 2% HSA HBSS. Incube 20 min em temperatura ambiente no escuro. Centrifugar a placa a 930 x g durante 10 min e remover o sobrenadante como indicado no passo 2.7. Adicione 200 μL de HSA HBSS a 2% e a placa centrífuga novamente, seguida pela remoção do sobrenadante como na etapa 2.7.
- Após a coloração de viabilidade, corar as células para marcadores leucocitários de interesse, incluindo minimamente uma coloração específica para CD45, como PE-camundongo anti-CD45 humano (clone HI30) em uma concentração otimizada (1 μg/μL em 50 μL de 1% BSA HBSS nos dados de exemplo).
nota: Quaisquer marcadores de interesse específicos da linhagem podem ser incluídos.
- Incube 20 min em temperatura ambiente no escuro. Centrifugar a placa a 930 x g durante 10 min e remover o sobrenadante como indicado no passo 2.7. Adicione 200 μL de 1% BSA HBSS e repita a centrifugação. Remova o sobrenadante. Fixe as células em 200 μL de formaldeído a 0,5% no escuro à temperatura ambiente por 30 min ou durante a noite a 4 ° C. Leve à geladeira no escuro até a análise.
5. Análise por citometria de fluxo
- Execute o gating inicial para eliminar dupletos em um gráfico de dispersão direta (FSC) vs. dispersão lateral (SSC) e detritos (material menor que FSC = 5000) (consulte a Figura 1). Use um gráfico SSC vs. coloração de viabilidade (V450 neste caso) para eliminar as células mortas (aquelas que são positivas para coloração de viabilidade).
- Use um gráfico SSC vs. CD45 para diferenciar as principais classes de leucócitos (granulócitos, monócitos, linfócitos) conforme amplamente descrito.
nota: Essa classificação é apenas sugestiva e marcadores específicos da linhagem são necessários para confirmar o tipo de célula.
- Para todas as células CD45+, ou para cada subconjunto de leucócitos de interesse, meça a atividade da ADCP por meio de um marcador nas células positivas para esferas em um histograma do canal de isotiocianato de fluoresceína (FITC), onde as esferas fluorescentes são detectadas.
nota: Os poços de controle negativo nos quais os grânulos não foram adicionados indicarão onde as células positivas para grânulos são aparentes no histograma e, portanto, onde colocar o marcador de gating.
- Calcule os escores ADCP como (intensidade média de fluorescência [MFI] de células positivas para bead) x (% do total de células CD45 + na população positiva). Use o software gráfico para traçar as pontuações em cada concentração de Ab/soro e realizar uma análise de área sob a curva (AUC).
nota: A ADCP é considerada positiva se a AUC for superior a 3x o desvio padrão da AUC da pontuação ADCP de um mAb de controlo negativo não específico (neste caso, 3865).
