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Artigo de método

Avaliação do influxo de cálcio induzido por receptor de células T usando um corante indicador de cálcio

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8 de julho de 2025

Neste artigo

Resumo

Fonte: Perrenoud, L. et al., Análise do influxo de cálcio induzido por receptor de células T em células T murinas primárias por citometria de fluxo de espectro total.J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo analisa o influxo de cálcio induzido por receptor de células T em células T. Os anticorpos anti-CD3 ativam as vias de sinalização das células T, levando a um aumento nos íons de cálcio intracelulares que se ligam ao corante Indo-1. Na citometria de fluxo, uma mudança de espectro do estado livre de cálcio para o estado ligado ao cálcio se correlaciona com o influxo de cálcio induzido pelo receptor de células T.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação de células imunes do baço de camundongo

NOTA: Eutanasiar camundongos virgens com eutanásia de dióxido de carbono (CO2). Camundongos C57BL / 6 comprados da Jackson Laboratories e criados internamente são usados para experimentos com 6-12 semanas de idade. Camundongos machos e fêmeas são utilizados para experimentos.

  1. Desinfete a pele do camundongo com etanol a 70% para reduzir a po....

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placas tratadas com TC de 12 poçosTratamento de células229111
50 mL cônicoGreiner Bio141-12-17-03Tubos de centrífuga de polipropileno de 50 mL com tampa
Tubos de fluxo de poliéster de 5mLCorning352052
Seringa de 5mLSeringa BD309646o êmbolo é usado apenas sheith é descartado
filtro 70uMGreiner bio1Rolamento 542070
aCD3 (17A2)Biolenda100202
Buffer de lise AKCGibcoA1049201
Flowcytometer espectral de Aurorahttps://cytekbio.com/pages/aurora
Contas de banhocoleparmerArtigo # UX-06274-52
CD19 PETonbo50-0193-U100
Tetrâmero CD1d APCNih
CD25 PECy7eBiociência15-0251
CD4 APC Cy7Tonbo25-0042-U100
CD8a FITCeBiociência11-0081-85
Incubadora de célulasCientífico formal
Ferramentas de dissecação fórcepsMcKesson#487593Pinça de Tecido McKesson Adson 4-3/4 Polegadas de Comprimento Aço Inoxidável Não Estéril Não Trava Cabo de Polegar 1 X 2 Dentes
Ferramentas de dissecação TesouraMcKesson#970135Tesoura de Operação McKesson Argent™ 4-1/2 Polegadas Grau Cirúrgico Aço Inoxidável Anel de Dedo Alça Reta Ponta Afiada / Ponta Afiada
DPBS 1xGibco14190-136DPBS
EGTApescadorNC1280093
FBSHyclondSH30071.03Lote AE29165301
Software FlowJohttps://www.flowjo.com/
Corante Indo1-AM ÉstereBiociênciaTelefone: 65-085-39Corante de carregamento de cálcio
IonomicinaMillipore407951-1mg
Fantasma Vivo/Morto 540Tonbo13-0879-T100
Tubos de microcentrífuga 1,7mLLaboratórios de LuzA-7001
Penicilina/estreptomicina/L-glutaminaGibco10378-016
PRN694Med Chem ExpressHy-12688
Anti-rato purificado CD16/CD32 (escudo FC) (2.4G2)Tonbo70-0161-M001Bloco FC
RPMIGibco1875093 + vermelho de fenol
RPMI sem fenolGibco11835030 -vermelho de fenol
Centrífuga de mesaBeckman CoulterAllegra612
TCRβ PerCP Cy5.5eBiociênciaTelefone: 45-5961-82
TCRγ/δ PE Cy5eBiociência15-5961-82
Pacote de Reagentes Vi-Cell BluNº do produto: C06019Inclui Tripan
Vi-Cell BluBeckman Coulter
Banho-mariaBanho seco da marca Fisher

Etiquetas

Citometria de FluxoCorante Indo 1Anticorpos Anti CD3Bloqueio do Receptor FcColora o com Corante de ViabilidadeIndo 1 Ligado ao C lcioIndo 1 Livre de C lcioTratamento com Ionomicina