Avaliação do influxo de cálcio induzido por receptor de células T usando um corante indicador de cálcio

Resumo

Fonte: Perrenoud, L. et al., Análise do influxo de cálcio induzido por receptor de células T em células T murinas primárias por citometria de fluxo de espectro total.J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo analisa o influxo de cálcio induzido por receptor de células T em células T. Os anticorpos anti-CD3 ativam as vias de sinalização das células T, levando a um aumento nos íons de cálcio intracelulares que se ligam ao corante Indo-1. Na citometria de fluxo, uma mudança de espectro do estado livre de cálcio para o estado ligado ao cálcio se correlaciona com o influxo de cálcio induzido pelo receptor de células T.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação de células imunes do baço de camundongo

NOTA: Eutanasiar camundongos virgens com eutanásia de dióxido de carbono (CO₂). Camundongos C57BL / 6 comprados da Jackson Laboratories e criados internamente são usados para experimentos com 6-12 semanas de idade. Camundongos machos e fêmeas são utilizados para experimentos.

1. Desinfete a pele do camundongo com etanol a 70% para reduzir a po....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas tratadas com TC de 12 poços	Tratamento de células	229111
50 mL cônico	Greiner Bio1	41-12-17-03	Tubos de centrífuga de polipropileno de 50 mL com tampa
Tubos de fluxo de poliéster de 5mL	Corning	352052
Seringa de 5mL	Seringa BD	309646	o êmbolo é usado apenas sheith é descartado
filtro 70uM	Greiner bio1	Rolamento 542070
aCD3 (17A2)	Biolenda	100202
Buffer de lise AKC	Gibco	A1049201
Flowcytometer espectral de Aurora	https://cytekbio.com/pages/aurora
Contas de banho	coleparmer	Artigo # UX-06274-52
CD19 PE	Tonbo	50-0193-U100
Tetrâmero CD1d APC	Nih
CD25 PECy7	eBiociência	15-0251
CD4 APC Cy7	Tonbo	25-0042-U100
CD8a FITC	eBiociência	11-0081-85
Incubadora de células	Científico formal
Ferramentas de dissecação fórceps	McKesson	#487593	Pinça de Tecido McKesson Adson 4-3/4 Polegadas de Comprimento Aço Inoxidável Não Estéril Não Trava Cabo de Polegar 1 X 2 Dentes
Ferramentas de dissecação Tesoura	McKesson	#970135	Tesoura de Operação McKesson Argent™ 4-1/2 Polegadas Grau Cirúrgico Aço Inoxidável Anel de Dedo Alça Reta Ponta Afiada / Ponta Afiada
DPBS 1x	Gibco	14190-136	DPBS
EGTA	pescador	NC1280093
FBS	Hyclond	SH30071.03	Lote AE29165301
Software FlowJo	https://www.flowjo.com/
Corante Indo1-AM Éster	eBiociência	Telefone: 65-085-39	Corante de carregamento de cálcio
Ionomicina	Millipore	407951-1mg
Fantasma Vivo/Morto 540	Tonbo	13-0879-T100
Tubos de microcentrífuga 1,7mL	Laboratórios de Luz	A-7001
Penicilina/estreptomicina/L-glutamina	Gibco	10378-016
PRN694	Med Chem Express	Hy-12688
Anti-rato purificado CD16/CD32 (escudo FC) (2.4G2)	Tonbo	70-0161-M001	Bloco FC
RPMI	Gibco	1875093	+ vermelho de fenol
RPMI sem fenol	Gibco	11835030	-vermelho de fenol
Centrífuga de mesa	Beckman Coulter	Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5	eBiociência	Telefone: 45-5961-82
TCRγ/δ PE Cy5	eBiociência	15-5961-82
Pacote de Reagentes Vi-Cell Blu		Nº do produto: C06019	Inclui Tripan
Vi-Cell Blu	Beckman Coulter
Banho-maria	Banho seco da marca Fisher