Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de células imunes do baço de camundongo
NOTA: Eutanasiar camundongos virgens com eutanásia de dióxido de carbono (CO2). Camundongos C57BL / 6 comprados da Jackson Laboratories e criados internamente são usados para experimentos com 6-12 semanas de idade. Camundongos machos e fêmeas são utilizados para experimentos.
- Desinfete a pele do camundongo com etanol a 70% para reduzir a possibilidade de contaminantes externos entrarem na amostra.
- Disseque o baço do camundongo usando ferramentas de dissecação, tesouras cirúrgicas e fórceps. Colha o baço e coloque o baço destacado em um tubo cônico de 50 mL com ~ 5 mL de meio completo do Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) no gelo.
nota: O RPMI completo é composto por 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina e 1% de penicilina/estreptomicina.
- Para colher o baço do rato, faça uma incisão de 5 cm no pelo e na pele ao longo do lado esquerdo do rato, a meio caminho entre as patas dianteiras e traseiras com uma tesoura. Abra a cavidade corporal ~5 cm e remova o baço usando uma pinça. O baço é da cor de um feijão e é mais longo e achatado que o rim vizinho.
- Despeje o conteúdo da etapa 1.2 em um filtro estéril de 70 μm conectado a um novo tubo cônico de 50 mL. Separe mecanicamente o baço em uma suspensão de célula única, empurrando o baço através do filtro com um êmbolo de seringa de 5 mL até que nenhuma polpa do baço permaneça na superfície do filtro.
- Pulverize os esplenócitos utilizando uma centrífuga de bancada de rotor basculante a 500 x g por 5 min a 4 ° C.
- Decantar cuidadosamente o sobrenadante. Os esplenócitos peletizados permanecem no fundo do tubo cônico de 50 mL.
- Para remover os glóbulos vermelhos, ressuspenda os esplenócitos peletizados em 1 mL de tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK) por 3 minutos de acordo com as instruções do fabricante. Misture bem.
- Resfrie o tampão de lise ACK com 15 mL de cRPMI.
- Pulverize os linfócitos conforme indicado na etapa 1.4.
- Ressuspenda a suspensão celular em 5 mL de cRPMI em um tubo cônico de 50 mL. Coloque as amostras no gelo.
- Para contar as células, transfira 10 μL da suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 0,6 mL e dilua na proporção de 1:1 com solução de azul de tripano. Em seguida, transfira para um hemocitômetro ou sistema automatizado de contagem de células.
- Após a contagem, dependendo da concentração celular em suspensão celular como na etapa 1.9, pelete as células em uma centrífuga de mesa a 500 x g a 4 ° C por 5 min para se preparar para a adição de meio cRMPI contendo corante éster Indo-1 AM.
- Calcule o volume para ressuspensão das células para atingir 10-12 x 106 células/mL. Esta é uma concentração de 2x da contagem total de células necessária.
- Ressuspenda as células no volume de cRPMI calculado na etapa 1.11. Coloque as células a 37 ° C com 5% de CO2 em um tubo cônico de 50 mL com a tampa ventilada ou em uma placa de cultura de tecidos.
2. Corante raciométrico Indo-1 e marcação de anticorpos fluorescentes
- De acordo com as instruções do fabricante, adicione 50 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) em um frasco contendo 50 μg de Indo-1 AM. A concentração da solução de reserva é de 1 μg/μL.
nota: O DMSO é fornecido em micro-frascos com o kit para evitar qualquer oxidação do DMSO.
- Diluir a alíquota de reserva (1 μg/μl) no volume experimental adequado (estabelecido no ponto 1.11) de cRPMI a uma concentração de 6 μg/ml, uma concentração de 2x. Não conservar o Indo-1 numa solução aquosa.
nota: Outros tampões com adição de cálcio podem ser usados dependendo das necessidades da célula.
- Reserve o meio completo com Indo-1 em banho-maria a 37 °C.
nota: Utilizar a concentração mínima de éster Indo-1 AM necessária para obter um sinal adequado. Isso precisa ser ajustado para vários tipos de células. Normalmente, uma concentração entre 3-5 μM é suficiente. Para células T primárias, o carregamento de células com Indo-1 a uma concentração >5 μg/mL aumenta a intensidade fluorescente média (MFI) acima de um log de 6 em citômetros de fluxo espectral. Se isso ocorrer, diminua a intensidade do laser ultravioleta (UV) e titule o Indo-1 para uma concentração mais baixa.
- Dilua a suspensão celular previamente preparada (na etapa 1.12), 1:1 em cRPMI, incluindo o meio Indo-1 2x feito na etapa 2.2. Certifique-se de que as células estejam em uma concentração entre 5-6 x 106/mL.
nota: Não tinga o controle de mancha única não manchado ou os controles de célula de mancha única do marcador de superfície com Indo-1. A adição de Indo-1 a controles de anticorpos de coloração única criará uma amostra multicolorida devido ao Indo-1 adicionado a células coradas únicas. Inclua o ácido etilenoglicol tetracético (EGTA) indo-1 (sem cálcio) adicionado controle à placa de amostra criada na etapa 2.6.
- Adicione 1 mL de células/poço/condição experimental em uma placa de cultura de tecidos de 12 poços.
- Crie um único controle corado para a amostra de Indo-1 (sem cálcio) usando células previamente carregadas com corante Indo-1 e adicione EGTA a uma concentração final de 2 mM. O EGTA quelará o cálcio na suspensão celular, fornecendo uma amostra de controle mais limpa.
- Crie um controle positivo Indo-1 (ligado ao cálcio Indo-1) adicionando 50 μM de ionomicina à suspensão de células carregadas com corante no citômetro de fluxo. A ionomicina é um ionóforo de cálcio permeável à membrana que se liga aos íons de cálcio e facilita a transferência de íons de cálcio para as células.
- Crie um poço para controle biológico negativo sem fluoróforos ou corante Indo-1.
- Crie um poço para controles de coloração única para quaisquer populações de células adicionais de interesse (anticorpos definidos pelo usuário) usando fluoróforos conjugados com anticorpos em um design de painel de citometria de fluxo. Isso não incluirá o corante raciométrico Indo-1.
- Adicione o anticorpo bloqueador do receptor Fc (~ 2 μg / 1 x 106 células), de acordo com as instruções do fabricante, antes de adicionar anticorpos conjugados com fluorocromo adicionais para coloração de superfície.
- Incubar a placa durante 45 min a 37 °C com 5% de CO2.
- Ressuspenda as células em uma placa de 12 poços batendo suavemente na placa a cada 15 minutos.
- Misture e remova todo o volume de células suspensas no meio da placa de 12 poços. Em seguida, adicione a suspensão celular a tubos de microcentrífuga de 1,7 mL.
- Pulverize as células em uma microcentrífuga a 500 x g por 5 min em temperatura ambiente. Transvase o sobrenadante e lave as células adicionando 1 ml de cRPMI pré-aquecido. Volte a decantar o sobrenadante.
nota: A lavagem das células remove qualquer anticorpo bloqueador Fc restante.
- Ressuspenda as células em 1 mL de cRPMI em tubos de microcentrífuga de 1,7 mL e incube cada tubo a 37 ° C por mais 30 min a 5% de CO2, deixando a parte superior do tubo ligeiramente aberta para permitir a troca gasosa. Isso permite a desesterificação completa dos ésteres AM intracelulares.
- Transfira as células de volta para uma placa de cultura de tecidos de 12 poços, se necessário. Anticorpos adicionais titulados conjugados com fluorocromo definidos pelo usuário podem ser adicionados em uma fase de repouso.
nota: Os marcadores usados no painel de métodos incluem: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 e tetrâmero CD1d/α-galcer. Os marcadores são escolhidos para analisar subconjuntos de células T.
- Crie uma mistura principal de todos os anticorpos conjugados com fluorocromo definidos pelo usuário de acordo com os tipos de células de interesse em um volume previamente titulado em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
- Adicione uma mistura principal calculada para 1 mL do volume celular, dependendo de anticorpos titulados para as células em repouso.
nota: A vantagem da coloração na etapa 2.15 em vez da etapa 2.18 posterior é que a coloração na etapa 2.15 diminuirá o tempo total de incubação do experimento. No entanto, a coloração em um volume total de 1 mL na etapa 2.15 aumenta o uso de anticorpos.
- Após o repouso, pulverize as células a 500 x g por 5 min em temperatura ambiente.
nota: As células em uma placa de cultura de tecidos de 12 poços podem ser peletizadas na placa com um acessório de centrífuga de placa. Caso contrário, coloque as células em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
- Lave as células ressuspendendo o pellet em 1 ml de cRPMI frio a 4 °C e volte a pulverizar as células como no passo 2.16. Coloque as células no gelo.
nota: Se as células de coloração da superfície separadamente, após a desesterificação na etapa 2.18, é necessário menos volume de anticorpos. A coloração da superfície nesta etapa pode ser realizada após a fase de repouso em tampão de fluxo frio (1x solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) com adição de 1% de FBS), usando anticorpos definidos pelo usuário, em gelo por 30 min. Lave as células após a coloração em cRPMI como na etapa 2.17.
- Adicione a mancha de viabilidade Ghost540 diluída 1:7.500 em DPBS às amostras de acordo com as instruções do fabricante. O calor mata as células a 55 °C em um bloco de aquecimento para controle de vivos/mortos com coloração única.
nota: A coloração funcional do corante de viabilidade para eliminar células mortas na análise por citometria de fluxo é realizada sem FBS. A FBS pode interagir com corantes de amina de acordo com as instruções do fabricante.
- Ressuspenda amostras individuais em 500 μL de cRPMI (sem vermelho de fenol) usando um tubo de fluxo de poliestireno de 5 mL com tampa.
nota: As células podem ser deixadas a 4 °C por até uma hora.
- Aquecer cada tubo de 5 ml contendo células, individualmente, a 37 °C utilizando um banho de esferas durante 7 minutos antes da análise no citómetro de fluxo, mantendo o tempo consistente entre as amostras. Use um cronômetro.
3. Tubo de banho de esferas: manutenção da temperatura durante a análise do fluxo de cálcio
- Adicione as contas de banho a um pequeno banho-maria sem adição de água; aqueça até 37 °C.
- Corte cuidadosamente um tubo cônico de 50 mL ao meio, na marca de 25 mL, com uma lâmina de barbear; descarte a parte superior do tubo.
- Encha o tubo cortado ao meio 3/4 do caminho com contas de banho.
- Coloque o tubo criado na etapa 3.2 no banho de contas criado na etapa 3.1. Leve o tubo e os grânulos a 37 °C.
- Conecte o banho de esferas a uma tomada elétrica próxima ao citômetro de fluxo para manter a temperatura em preparação para a análise da amostra.
- Adicione um rack cônico de isopor de 50 mL cortado para segurar um tubo para posicionar o tubo no lugar enquanto estiver funcionando no citômetro de fluxo. Isso eliminará a necessidade de segurar manualmente o tubo durante a análise da curva.
