Um ensaio para quantificar a ligação de VLPs de norovírus humano a bactérias intestinais

Resumo

Fonte: Madrigal, J. L., et al. Quantificando partículas semelhantes ao vírus do norovírus humano que se ligam a bactérias comensais usando citometria de fluxo. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra um ensaio para quantificar a ligação de partículas semelhantes a vírus de norovírus humano (VLPs) a bactérias intestinais humanas. As suspensões bacterianas são misturadas com as VLPs e incubadas para permitir a formação de complexos VLP-bactérias. Os complexos são então marcados com anticorpos específicos de VLP marcados com fluoróforo, seguidos de visualização e quantificação baseadas em citometria de fluxo para identificar a porcentagem de bactérias ligadas à VLP.

Protocolo

1. Ensaio de fixação de bactérias VLP

CUIDADO: As VLPs de norovírus humano são um risco de nível de biossegurança (BSL)-2, e todo o trabalho envolvendo VLPs deve ser realizado em um gabinete de biossegurança. A preparação das culturas bacterianas antes do ensaio de fixação deve ser realizada em condições de segurança adequadas para o organismo.

1. Preparação de reagentes
   1. 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS)
      1. Prepare 1 L de 10x PBS dissolvendo um pacote em 1 L de água deionizada (DI).
      2. Solução em autoclave por 30 min.
      3. Prepare uma solução 1x diluindo a solução acima 1:10 em água DI.
      4. Esterilize a solução por filtro passando-a por um filtro de 0,22 μm e armazenando-a à temperatura ambiente.
   2. 5% BSA
      1. Adicione 5 g de pó de albumina de soro bovino (BSA) a 100 mL de PBS para gerar uma solução a 5% (p / v).
      2. Misture a solução por vórtice ou usando uma barra de agitação de metal em uma placa de agitação até que os grumos se dissolvam.
      3. Esterilize o filtro usando um filtro de 0,22 μm.
      4. Conservar a solução a 4 °C.
   3. Tampão de coloração por citometria de fluxo (FCSB)
      1. Filtro adquirido FCSB (consulte a Tabela de Materiais) através de um filtro de 0,22 μm.
      2. Conservar a solução restante a 4 °C.
   4. 5% Buffer de Bloqueio (BB)
      nota: Prepare fresco a cada vez.
      1. Adicione 0,5 g de BSA a 10 mL de FCSB estéril.
      2. Vortex para misturar bem a amostra e deixar no gelo até o uso.
2. Conjugação de anticorpos
   1. Conjugue o anticorpo GII do norovírus humano (consulte a Tabela de Materiais) com r-ficoeritrina (PE) usando um kit de rotulagem de anticorpos R-PE de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
   2. Armazene o anticorpo conjugado no escuro a 4 °C para uso futuro na análise do ensaio de ligação da bactéria VLP.
      nota: O anticorpo primário deve ser titulado antes do uso no ensaio de fixação de bactérias VLP para determinar a concentração adequada necessária para a análise de citometria de fluxo. A titulação de anticorpos deve ser realizada sempre que a reação de conjugação for realizada e para cada bactéria usada no ensaio de fixação.
3. Titulação de anticorpos
   1. Diluir o anticorpo conjugado anti-norovírus humano GII 100 vezes, com uma diluição inicial de 1:100 e uma diluição final de 1:600 (seis diluições no total).
   2. Realize um ensaio de fixação do vírus conforme descrito abaixo, com a seguinte exceção: na etapa 1.5.7, ressuspenda o pellet bacteriano em 350 μL de 5% BB.
   3. Dividir a amostra em sete alíquotas de 50 μL.
   4. Adicione 50 μL de cada diluição de anticorpo a um tubo.
   5. Adicione 50 μL de BB a 5% ao sétimo tubo como um controle não corado.
   6. Realizar citometria de fluxo em todas as amostras, conforme descrito abaixo.
   7. Comparar amostras de anticorpos diluídos com controlos não corados e entre si. A concentração mais baixa de anticorpos que não resulte em diminuição ou perda de sinal positivo deve ser escolhida para ensaios subsequentes.
4. Preparação de bactérias
   1. Cultive as bactérias em 40 mL de meio líquido apropriado sob condições atmosféricas adequadas até que as bactérias estejam na fase estacionária.
      1. Cultive culturas de Enterobacter cloacae aeróbicas durante a noite em caldo Luria a 37 ° C, agitando a 200 rpm para atingir a fase estacionária.
      2. Cultive culturas de Lactobacillus gasseri em caldo De Man, Rogosa e Sharpe (MRS) em tubos com tampa de rosca preta sem agitar em banho-maria regulado para 37 °C por 18 h para atingir a fase estacionária.
   2. Transfira culturas de fase estacionária para limpar tubos cônicos de 50 mL e centrifugue amostras a 2.288 x g por 10 min para peletar as bactérias.
   3. Remova o sobrenadante e ressuspenda-o em 13 mL de PBS 1x estéril. Repita esta etapa de lavagem para um total de duas lavagens.
   4. Centrifugue as amostras novamente, remova o sobrenadante e ressuspenda as amostras em 20 mL de 1x PBS.
      nota: Se o pellet celular for pequeno, o volume de ressuspensão pode ser diminuído.
   5. Meça o OD₆₀₀ da cultura.
   6. Usando uma curva padrão, determine a unidade formadora de colônias (UFC) por mL da cultura lavada.
   7. Dilua as bactérias com 1x PBS para ajustar a concentração da cultura para 1 x 10⁸ UFC/mL.
   8. Transfira 1 mL da cultura bacteriana de 1 x 10⁸ UFC/mL para os tubos de centrífuga de 1,5 mL necessários.
   9. Centrifugue os tubos a 10.000 x g por 5 min.
   10. Ressuspenda o pellet bacteriano em 1 mL de BSA estéril a 5%.
   11. Incubar os tubos durante 1 h a 37 °C com rotação constante.
5. Anexo de vírus
   1. Trabalhando dentro de um gabinete de biossegurança BSL-2, adicione 10 μg de VLPs de norovírus humano (HuNoV) (consulte a Tabela de Materiais) a cada tubo contendo bactérias ressuspensas em PBS e misture bem por pipetagem.
      nota: A concentração de VLP difere com cada preparação de VLP. Portanto, o volume adicionado às bactérias varia entre os lotes de preparação e deve ser ajustado de acordo para que 10 μg sejam adicionados a cada tubo no experimento. Para controles somente de bactérias (por exemplo, amostras sem VLP), adicione um volume de PBS igual ao volume de VLP adicionado às amostras experimentais.
   2. Incubar os tubos por 1 h a 37 °C com rotação constante.
      NOTA: Um revólver de tubo (consulte a Tabela de Materiais) ajustado para 40 rpm é usado durante a incubação.
   3. Após a incubação, centrifugue as amostras a 10.000 x g por 5 min.
   4. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet bacteriano em 1 mL de PBS.
   5. Repita as etapas de lavagem 1.5.3 e 1.5.4.
   6. Centrifugue as amostras a 10.000 x g por 5 min.
   7. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento bacteriano em 150 μL de BB a 5%.
6. Coloração de anticorpos
   1. Prepare fresco 5% BB.
      NOTA: Todo o trabalho usando o anticorpo marcado com fluorescência deve ser realizado no escuro, e o anticorpo, BB e FCSB devem ser mantidos no gelo.
   2. Diluir o anticorpo GII do norovírus humano 1:125 para amostras de E. cloacae e 1:150 para amostras de L. gasseri em 5% de BB, preparando 50 μL de anticorpo diluído por amostra.
   3. Diluir o anticorpo isotipo da mesma forma que o anticorpo GII do norovírus humano foi diluído para cada bactéria em 5% BB, preparando 50 μL de controle isotipo diluído por amostra.
   4. Divida cada amostra de ensaio de fixação da etapa 1.3.7 em três alíquotas de 50 μL, transferindo-as para tubos de centrífuga limpos de 1,5 mL.
   5. Ao primeiro conjunto de amostras, adicione 50 μL de BB. Este conjunto será os controles não corados (Uns).
   6. Adicionar 50 μL da diluição do anticorpo GII ao segundo conjunto. Isso resulta em uma concentração final de anticorpos de 1:250 para E. cloacae e 1:300 para L. gasseri. Este conjunto de amostras será as amostras coradas (AB).
   7. Adicionar 50 μL do anticorpo isotipo diluído ao terceiro conjunto. Este conjunto será o controle de isotipo (IC). Misture bem pipetando. Incube as amostras no gelo e no escuro por 30 min.
   8. Centrifugue todas as amostras a 10.000 x g por 5 min.
   9. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as amostras em 100 μL de FCSB.
   10. Centrifugue todas as amostras a 10.000 x g durante 5 min. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as amostras em 100 μL de FCSB.
   11. Centrifugue todas as amostras a 10.000 x g por 5 min.
   12. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as amostras em 150 μL de FCSB.
   13. Transfira cada amostra para um tubo FCSB contendo 400 μL de tampão FCSB para um volume total de 550 μL.
   14. Manter as amostras a 4 °C até que sejam analisadas por citometria de fluxo.
       nota: A citometria de fluxo é realizada dentro de 4 h após a coloração do anticorpo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 ml com tampa de filtro de célula	Corning	352235	Após a coloração do anticorpo, a amostra é transferida para tubos para análise de citometria de fluxo.
Pacote Anaero	Thermo Científico	R681001	Pacote de gás anaeróbio usado para cultura de Lactobacillus gasseri
Software BD FacsDiva
Citômetro de fluxo BD LSR Fortessa
Albumina de soro bovino	Biorreagentes Fisher	BP1605	Usado para citometria de fluxo
Tampão de Coloração por Citometria de Fluxo (FCSB)	BD Biociências	554657	Usado para citometria de fluxo
Controle de isotipo de camundongo IgG2b kappa (eBMG2b), PE, eBioscience	Thermo Fisher Científico	12473281	Controle de isotipo. Este anticorpo é adquirido na forma conjugada do fabricante.
MRS em pó	BD Biociências	Rolamento 288130	Usado para preparação de meios e cultura de Lactobacillus gasseri.
Anticorpo monoclonal G2 do capsídeo de norovírus (L34D)	Thermo Fisher Científico	MA5-18241	Norovírus Este anticorpo está disponível apenas na forma não conjugada e, portanto, deve ser conjugado com fluorescência antes do uso nos ensaios de citometria de fluxo descritos. Neste protocolo, o PE foi o fluor escolhido, no entanto, outras moléculas fluorescentes podem ser escolhidas como melhor se adequam ao citômetro de fluxo que está sendo utilizado pelo pesquisador.
Norovírus GII.4 VLP	Bioestrutura criativa	CBS-V700	As VLPs foram geradas usando o sistema de baculovírus e ressuspensas em solução salina tamponada com fosfato a 10%. Os autores realizaram uma análise independente de rastreamento nanosight para determinar a concentração de partículas dos VLPs. A concentração é de aproximadamente 1011 VLPs por mililitro. Com base na concentração de proteína das VLPs, aproximadamente 200 partículas são adicionadas por bactéria em ensaios de fixação de VLP.
PBS 10X	Biorreagentes Fisher	BP665	Diluir para 1X antes de usar.
Kit de rotulagem de anticorpos SiteClick R-PE	Thermo Fisher Científico	S10467	Kit de conjugação usado para rotular anticorpo não conjugado.
cloreto de sódio	Fisher Científico	S271	Usado para preparação de mídia
Triptona	Oxóide	LP0042	Usado para preparação de mídia
revólver de tubo	ThermoFisher Scientific	88881001	Usado no ensaio de fixação de vírus: bactérias. Defina para a velocidade máxima (40 rpm).
Extrato de levedura	BD Biociências	Rolamento 212750	Usado para preparação de mídia
Ágar	sigma	Rolamento A7002	Usado para preparação de mídia