1. Detecção de mitofagia em C. elegans
NOTA: O nematóide C. elegans fornece uma plataforma para testar a mitofagia no nível do organismo. Duas cepas podem ser usadas para monitorar a mitofagia: (1) Rosella direcionada às mitocôndrias (mtRosella) ou (2) receptor de mitofagia DCT-1 fundido com GFP junto com o marcador autofagossomal LGG-1 fundido com Discosoma sp. proteína fluorescente vermelha (DsRed).
- Monitoramento de mitofagia usando o biossensor Rosella
NOTA: Rosella é um biossensor molecular que combina um DsRed insensível ao pH fundido a uma variante GFP sensível ao pH. O biossensor Rosella aproveita as diferenças de pH entre o lisossomo ácido (pH ~ 4,5) e outros compartimentos celulares. Este biossensor tem sido usado para monitorar com sucesso a mitofagia em Saccharomyces cerevisiae e várias linhagens celulares de mamíferos, como HeLa, HEK293 e HCT116. Adaptamos este versátil repórter de fluorescência dupla e geramos nematóides transgênicos de C. elegans expressando Rosella (mtRosella) direcionada às mitocôndrias em células musculares da parede corporal. A indução da mitofagia é indicada por uma proporção reduzida de GFP / DsRed de fluorescência mtRosella.
- Dia 1: Escolha larvas L4 de vermes que expressam Rosella (mtRosella) direcionada às mitocôndrias em células musculares da parede corporal em uma placa de Meios de Crescimento de Nematóides (NGM) semeada com E. coli (OP50) usando um microscópio de dissecação. Coloque 10-20 minhocas/placa em pelo menos três placas de 3,5 cm. Incubar os nematóides à temperatura padrão de 20 °C.
nota: Veja a referência para a anatomia do verme, incluindo a identificação de larvas L4 e a maneira de fazer uma picareta que é usada para transferir vermes de um local para outro.
- Dia 5: Sincronize os nematóides selecionando 15-20 larvas transgênicas L4 e transferindo-as para uma placa NGM fresca semeada com OP50. Use pelo menos cinco placas por condição experimental.
- Dia 7: Prepare as placas dos veículos para medicamentos de interesse ou controles positivos que afetam a mitofagia.
- Mate a bactéria E. coli (OP50) semeada expondo placas NGM por 15 min com 222 μW / cm2 (intensidade) de luz UV para garantir que os compostos indutores de mitofagia não sejam metabolizados por bactérias. As placas devem ser expostas com 2.000 J/m2.
NOTA: Segundos de exposição necessários = 2.000/((intensidade em μW/cm2)*100).
- Adicione o(s) composto(s) de interesse ao topo das placas NGM semeadas. Adicione uma quantidade equivalente de veículo composto (solvente usado para dissolver o composto, como dimetilsulfóxido (DMSO)) às placas do veículo como controle negativo. Para o controle positivo da indução da mitofagia, foi utilizado um tóxico mitocondrial, o paraquat (concentração final de 8 mM). Adicione uma solução contendo 10 μL de estoque de paraquat 8 M com 190 μL de ddH2O na parte superior da placa de ágar para o grupo de tratamento. Para o grupo veículo, adicionar uma solução contendo 10 μL de DMSO com 190 μL de ddH2O na parte superior da placa de ágar.
nota: A solução de trabalho com paraquat pode ser mantida por 1 mês a 4 °C.
- Agite suavemente as placas até que o medicamento ou veículo cubra toda a superfície. Deixe as placas secarem com as tampas fechadas em temperatura ambiente por pelo menos 1 h antes de transferir as minhocas.
nota: As placas de medicamentos também podem ser preparadas adicionando medicamentos no NGM líquido antes que ele se solidifique.
- Dia 7: Transferir de 10 a 20 animais transgênicos adultos de 2 dias de idade preparados na etapa 2.1.2 para placas contendo paraquat, composto(s) de interesse ou veículo (DMSO). Incubar os animais transgénicos a 20 °C durante 2 dias.
- Dia 9: Prepare almofadas de agarose a 2%. Em seguida, adicione uma gota (10 μL) de 20 mM de levamisol em M9 por almofada. Imobilize os animais transgênicos para geração de imagens, colocando-os na gota de levamisol M9. Coloque delicadamente uma lamínula na parte superior.
- Capture animais transgênicos únicos usando uma câmera conectada a um microscópio de epifluorescência. Adquira imagens fluorescentes de nematóides transgênicos inteiros expressando mtRosella em células musculares da parede corporal com ampliação de 10X. Salve as imagens coletadas.
- Processe as imagens adquiridas com o software ImageJ. Analise as células musculares da parede corporal localizadas na cabeça do verme para evitar a autofluorescência no tecido intestinal. Meça o valor médio da intensidade do pixel e a área total para cada imagem fluorescente apenas da região da cabeça de cada animal. Para analisar a área específica de interesse:
- Selecione 'dividir canal' no menu suspenso 'imagem' e 'cor' para converter imagens.
- Utilize a ferramenta de 'seleção à mão livre' para capturar a área fluorescente de interesse.
- Selecione o comando 'medição' no menu suspenso 'analisar' e execute a análise de intensidade de pixel.
- A intensidade do pixel deve ser normalizada dividindo a intensidade pela área total analisada. Após a normalização, calcule a proporção GFP para DsRed.
- Use o software de análise estatística para realizar o teste t de Student (comparação entre dois grupos) ou ANOVA (comparação entre vários grupos) para análise estatística com p < 0,05 como significativo.
- Avaliação da mitofagia usando co-localização entre DCT-1 e LGG-1
NOTA: DCT-1 é uma proteína externa da membrana mitocondrial que atua como um receptor de mitofagia em resposta a condições de estresse, semelhante aos seus ortólogos putativos BNIP3 e NIX/BNIP3L em mamíferos. Assim, o início da mitofagia é avaliado pela co-localização entre o receptor de mitofagia DCT-1 e a proteína de membrana autofagossômica LGG-1 (homóloga da LC3 de mamíferos).
- Dia 1: Escolha larvas L4 de animais transgênicos expressando DCT-1::GFP e DsRed::LGG-1 em células musculares da parede corporal5 em uma placa NGM semeada OP50. Coloque 5-10 minhocas/placa de 3,5 cm e use pelo menos três placas. Incubar os nematóides a 20 °C.
nota: Os transgenes estão localizados em plasmídeos separados e não estão integrados no genoma. Pegue nematóides carregando marcadores de contransformação rol-6 (su1006) e pmyo-2 GFP. Apenas vermes transgênicos com ambos os marcadores de contransformação expressam DCT-1::GFP e DsRed::LGG-1 em células musculares da parede corporal.
- Siga as etapas de 1.1.2-1.1.5.
- Imagem de células musculares de parede corporal única usando uma câmera conectada a um microscópio confocal. Detecte as bordas de células musculares inteiras da parede do corpo e tire imagens da pilha z com ampliação de 63x. Maior ampliação também pode ser usada.
- Abra e processe imagens adquiridas com o software confocal. O início da mitofagia é indicado pela co-localização do receptor de mitofagia (DCT-1::GFP) para o marcador autofagossomal (DsRed::LGG-1). Meça manualmente os eventos de co-localização em cada pilha de células musculares da parede corporal. É essencial manter todas as configurações do microscópio e da câmera (lente e lupa, filtros, tempo de exposição, resolução, intensidade do laser, ganho, etc.) consistentes ao longo dos experimentos. Todas as configurações devem ser anotadas.
- Use o software de análise estatística para realizar o teste t de Student (comparação entre dois grupos) ou ANOVA (comparação entre vários grupos) para análise estatística com p < 0,05 como significativo. Para comparações bidirecionais, use o teste t de Student (p < 0,05 é considerado significativo). Para comparações múltiplas, utilizar a análise de variância de fator único (ANOVA), corrigida pelo teste post hoc de Bonferroni. Recomendamos analisar pelo menos 50-70 animais ou 30-50 células musculares da parede corporal para cada condição experimental. Repita o experimento pelo menos três vezes.
