Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparação de tampões e reagentes
NOTA: Prepare todas as amostras de acordo com as diretrizes do fabricante. Durante este procedimento, use equipamentos de proteção individual (jalecos, luvas e óculos de proteção).
- Prepare o tampão de lavagem de citrato combinando 0,941 g de sacarose (concentração final de 11 mM), 6,4 mL de cloreto de sódio 5 M (NaCl, 128 mM final), 5,4 mL de fosfato monossódico 0,2 M (NaH2PO4, 4,3 mM final), 9,4 mL de fosfato dissódico 0,2 M (Na2HPO4, 7,5 mM final), 0,352 g de citrato de sódio (4,8 mM final), e 0,115 g de ácido cítrico (2,4 mM final). Ajuste o volume total para 250 mL com ddH2O. Filtre através de um disco de filtro de 0.45 μm e ajuste o pH para 6.5. Conservar até 1 ano a 4 °C. Levar a solução à temperatura ambiente (RT) antes de utilizar.
- Preparar o tampão de ruptura combinando 250 mM de sacarose, 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e 10 mM de cloridrato de Tris (hidroximetil) aminometano (Tris-Cl, pH 7,4) num volume final de 100 ml. Conservar até 1 ano a 4 °C. Adicionar 2 μL de cocktail de inibidores da fosfatase (1:1000 final) e 1 μL de cocktail de inibidores da protease (1:2000 final) a 2 ml de tampão de ruptura. Mantenha no gelo até o uso. Descarte o buffer de ruptura não utilizado.
2. Isolamento plaquetário
- Colete 8 a 10 mL de sangue humano em um tubo de coleta de sangue com tampa amarela contendo solução de ácido citrato-dextrose (ACD) (75 mM de citrato trissódico, 124 mM de dextrose e 38 mM de ácido cítrico, pH = 7,4; DAC: sangue = 1:9). Misture suavemente o conteúdo do tubo 5x–6x invertendo manualmente.
- Centrifugue os tubos a 200 x g em um rotor de balde oscilante por 20 min em RT.
- Colete plasma rico em plaquetas (PRP) (~ 3-4 mL) em um tubo inferior cônico de 15 mL e deixe aproximadamente 0,5 mL do PRP do revestimento leucocitário (fração de aparência nebulosa) para evitar contaminação. Se ocorrer alguma contaminação dos glóbulos vermelhos, repita esta etapa.
- Centrifugue as amostras de PRP a 1.200 x g por 15 min em RT.
- Lave os grânulos de plaquetas (P1) por ressuspensão suave em 1 mL de tampão de lavagem de citrato e pellet por centrifugação a 1.200 x g por 15 min em RT.
- Guarde o grânulo de plaquetas puras. Descarte o sobrenadante.
- Ressuspenda os grânulos de plaquetas em 600 μL do tampão de ruptura contendo coquetéis inibidores.
- Sonicar a suspensão plaquetária usando um sonicador. Coloque a amostra em um mini balde de gelo. Defina o sonicador na configuração 3 por 20 s no modo contínuo.
NOTA: Limpe a sonda com alvejante a 10% seguido de água destilada.
- Centrifugue as amostras sonicadas a 20.000 x g durante 30 min a 4 °C para remover as fracções membranosas. Alíquotas sobrenadantes em 60 μL e armazenar a -80 °C. Evitar ciclos repetidos de descongelamento/congelação para as fracções citosólicas plaquetárias.
3. Preparação para imunoensaio de eletroforese capilar (CEI)
NOTA: 100 μL de lisado de plaquetas humanas foram combinados de pacientes com ELA (n = 8–10) e indivíduos saudáveis (n = 8–10) foram agrupados separadamente e usados para a otimização do ensaio.
- Preencha os modelos gerados internamente para o layout do CEI (Tabela 1) e preparação da amostra (Tabela 2). A tabela de preparação da mistura de amostras é dinâmica e calculará automaticamente quanto volume precisa ser removido da fonte.
NOTA: Quando o volume de origem necessário é inserido na Tabela 2 dinâmica, o volume do buffer de amostra de 0,1 X será calculado automaticamente.
- Pré-rotule 25 tubos de PCR de 0,2 mL com capilares #1–#25 e coloque-os em um rack de PCR. Colocado no gelo.
- Pré-rotular tubos de microcentrífuga de 0,6 mL: um para cada anticorpo primário e diluição (se necessário) a ser usado, um para o tampão de amostra 0,1x, um para o luminol-S/peróxido e um para cada amostra a ser diluída (se necessário). Coloque-os no gelo em uma prateleira de tubos.
- Retire o sample tampão, tampão de lavagem, uma placa e um cartucho fornecidos no módulo de separação do kit mestre de separação CEI de 12–230 kDa.
- Retirar do frigorífico a 4 °C o tampão de diluição de anticorpos, os anticorpos primários, os anticorpos secundários, o luminol, o peróxido de hidrogénio e a embalagem padrão. Coloque todos os reagentes no gelo, exceto a embalagem padrão, que permanece em RT.
NOTA: Os reagentes das embalagens padrão são liofilizados e selados com uma tampa de alumínio. Para reduzir a perda de produto, estes devem ser girados brevemente usando uma mini centrífuga antes de abrir. Para abrir, os tubos de reagentes podem ser perfurados por uma ponta de pipeta ou puxados para trás do canto.
- Para preparar o ditiotreitol (DTT) 400 mM, adicione 40 μL de água deionizada ao tubo transparente que contém o DTT.
- Para preparar 40 μL de master mix fluorescente 5x, adicione 20 μL do tampão de amostra 10x e 20 μL da solução DTT 400 mM preparada ao tubo rosa fornecido no kit.
- Para preparar a escada biotinilada, adicione 16 μL de água deionizada, 2 μL de tampão de amostra 10x e 2 μL da solução preparada de 400 mM DTT ao tubo branco fornecido no kit. Misture delicadamente e transfira para um tubo de reação em cadeia da polimerase (PCR) de 0,2 mL para desnaturação.
- Prepare 0,1x tampão de amostra adicionando 1,5 μL de 10x tampão de amostra e 148,5 μL de água deionizada a um tubo de microcentrífuga de 0,6 mL. Vórtice para misturar e colocar no gelo.
- Prepare as diluições de anticorpos desejadas. Adicione diluente de anticorpos em volumes designados para cada tubo de microcentrífuga pré-rotulado. Se os volumes forem idênticos, use a técnica de pipetagem reversa; caso contrário, enxágue previamente a ponta da pipeta antes de dispensar.
NOTA: O anticorpo pan A-TDP-43 e o anticorpo a-p (S409 / 410-2) TDP-43 foram usados neste ensaio. O anticorpo anti-ERK foi usado para controle interno para garantir que os componentes do ensaio estivessem funcionando.
- Execute a pipetagem reversa para diluição de anticorpos conforme descrito abaixo. Alternativamente, informações adicionais podem ser encontradas na literatura.
NOTA: A pipetagem reversa é preferida ao dispensar pequenos volumes sequenciais de soluções. Esta técnica oferece algumas vantagens: (i) fornecer um volume preciso, (ii) eliminar a formação de espuma do reagente no orifício da ponta e (iii) ideal para reagentes de pequeno volume (<5 μL), soluções viscosas, soluções surfactantes e soluções com alta pressão de vapor.
- Coloque uma ponta adequada em uma pipeta e pressione o êmbolo até a segunda parada (Etapa 2). Mergulhe a ponta da pipeta alguns milímetros na solução. Solte lentamente o êmbolo para encher a ponta da pipeta com a solução enquanto a ponta ainda está imersa. Remova a ponta da solução e toque suavemente contra a borda do reservatório de reagente para que o excesso de líquido restante na parte externa da ponta seja removido.
- Dispense a solução pressionando o êmbolo até o primeiro batente (Etapa 1). Não dispense a solução restante na ponta.
- Esvazie a solução restante na ponta para o reservatório de reagente pressionando o êmbolo até a segunda parada (Etapa 2). Solte o êmbolo para a posição pronta para a próxima etapa de pipetagem.
- Adicione o anticorpo necessário em volumes designados para cada tubo de microcentrífuga pré-rotulado (Tabela 1). Não enxágue previamente a ponta da pipeta: adicione-a diretamente ao diluente e lave a ponta várias vezes para remover o anticorpo. Coloque os tubos no gelo.
- Para preparar a mistura de amostras CEI, execute as etapas listadas abaixo para tubos de PCR rotulados como cap#2 a cap#25: Isso está na mesma ordem da Tabela 1.
- Abra todos os tubos, adicione alíquotas de 1,6 μL de tampão de amostra fluorescente 5x a cada tubo usando uma técnica de pipetagem reversa e, em seguida, feche cada tubo de PCR após a adição do tampão 5x para minimizar a perda de amostra.
- Abra todos os tubos, adicione 0,1x tampão de amostra em volumes designados na Tabela 2 a cada tubo e feche imediatamente depois. Se os volumes forem idênticos, use uma técnica de pipetagem reversa. Caso contrário, enxágue previamente a ponta da pipeta antes de dispensar 0,1x tampão de amostra.
- Abra todos os tubos, adicione a amostra de proteína nos volumes designados na Tabela 2 a cada tubo e feche imediatamente depois. Se os volumes forem idênticos, use a técnica de pipetagem reversa. Caso contrário, enxágue previamente a ponta da pipeta antes de dispensar 0,1x tampão de amostra.
- Centrifugue brevemente todos os tubos de PCR em uma centrífuga de bancada (13.000 x g por 30 s), mova os tubos de PCR para misturar e repita a centrifugação.
- Transfira todos os tubos de PCR para um termociclador com tampa aquecida. Desnaturar amostras em temperatura e duração definidas (ou seja, 95 °C por 5 min; 70 °C por 10 min).
NOTA: A temperatura e a duração da desnaturação devem ser otimizadas para a proteína alvo.
- Repita a etapa 3.12.4.
- Retorne todos os tubos de PCR para o suporte de tubos e coloque-os no gelo.
- Durante a etapa de desnaturação, prepare a solução de revelação (1:1 luminol-S: solução de peróxido) e, em seguida, adicione 200 μL de luminol-S e 200 μL de peróxido. Coloque no gelo.
- Para carregar uma placa pré-cheia de CEI com a amostra preparada acima, dispense reagentes e amostras na placa de ensaio mostrada no layout do ensaio (Figura 1). Evite a introdução de bolhas de ar.
NOTA: Se os volumes e a solução forem idênticos, use uma técnica de pipetagem reversa. Caso contrário, enxágue previamente a ponta da pipeta antes de dispensar e não expulse o restante para o poço da placa usando o segundo batente na pipeta. Um módulo de separação de 12 a 230 kDa pode conter um guia de carregamento de chapa codificado por cores. Coloque este guia sob a placa enquanto adiciona reagentes e amostras ao poço, o que ajuda visualmente no carregamento da amostra. O guia de carregamento de chapas também pode ser baixado do site da empresa.
- adicionar 15 μL de mistura de luminol: peróxido a cada poço na linha E.
NOTA: O ideal é preparar este reagente antes de usar e adicioná-lo a cada poço. Se isso for inconveniente, esta mistura pode ser preparada no máximo 30 minutos antes do carregamento da placa.
- Na linha D, ao poço D1, adicione 10 μL de estreptavidina-HRP.
- Na linha D, aos alvéolos D2–D25, adicione 10 μL de anticorpo secundário designado.
- Na linha B, adicione 10 μL de diluente de anticorpos a cada poço.
- Na linha C, ao poço C1, adicione 10 μL de diluente de anticorpo.
- Na linha C, aos alvéolos C2–C25, adicione 10 μL de anticorpo primário designado.
- Na linha A, ao poço A1, adicione 5 μL de escada biotinilada do tubo de PCR #1.
- Na linha A, aos poços A2–A25, adicione 3 μL da amostra, tubos de PCR #2–#25 nos poços correspondentes #2–#25.
- Adicione 500 μL de tampão de lavagem a cada poço tampão de lavagem designado.
- Centrifugue a placa por 5 min a 1.000 x g em RT.
Tabela 1: Modelo de carregamento da placa de ensaio CEI.
Tabela 2: Modelo interativo de preparação de mistura de amostras. Depois de inserir a concentração de proteína de estoque de amostras desconhecidas, as células interativas calcularão automaticamente quanto volume deve ser usado para preparar a mistura de amostras.
