Um imunoensaio baseado em nanopartículas magnéticas usando um dispositivo microfluídico

Resumo

Fonte: Hernández-Ortiz, J. A., et al. Microfresagem de Controle Numérico Computadorizado de um Dispositivo Acrílico Microfluídico com Restrição Escalonada para Imunoensaios Baseados em Nanopartículas Magnéticas. J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo demonstra um sistema microfluídico para um imunoensaio baseado em nanopartículas magnéticas. O sistema de detecção utiliza um dispositivo microfluídico que incorpora uma armadilha magnética em seus canais. Imunocomplexos pré-formados, compostos por nanopartículas magnéticas revestidas com antígeno ligadas a anticorpos primários e secundários conjugados com peroxidase, são introduzidos nos canais. Os imunocomplexos são capturados na armadilha magnética porosa após a aplicação de um campo magnético externo. Usando um substrato fluorogênico que emite fluorescência após catálise pelas peroxidases, os imunocomplexos capturados são detectados ao microscópio.

Protocolo

1. Preparação do dispositivo

1. Encha os canais com água destilada usando uma seringa. Certifique-se de que não haja vazamentos ou resistência ao fluxo. Mergulhe o dispositivo em um banho ultrassônico por 10 minutos para remover qualquer material acrílico, adesivo ou indesejado restante dentro dos canais.
2. Esvazie a água dentro dos canais do dispositivo. Use uma seringa para introduzir uma solução de bloqueio preparada com albumina de soro bovino (BSA) a 5% (p / v) diluída em solução salina tamponada com 1x Tris (TBS) e previamente filtrada através de um filtro de seringa de polietersulfona (PES) de 0,2 μm.
3. Preparar uma suspensão de micropartículas de ferro de 7,5 μm de diâmetro em 5% BSA.
   nota: As micropartículas são previamente funcionalizadas com uma camada de sílica-polietilenoglicol (PEG) que confere resistência à absorção de proteínas.
4. Incubar a pastilha e a suspensão de micropartículas com a solução de bloqueio durante, pelo menos, 1 h à temperatura ambiente. Se possível, deixe bloquear durante a noite a 4 °C.

2. Formação de armadilhas de micropartículas

1. Insira as micropartículas no chip com uma agulha de seringa através da mangueira de saída do canal lateral. Coloque o chip verticalmente e permita que as micropartículas fluam sob o efeito da gravidade através do canal lateral. Gire o chip 180° em duas etapas de 90° e permita que as micropartículas atinjam e compactem na restrição de 5 μm.
2. Remova o excesso de micropartículas girando 45° por gravidade em direção ao canal lateral.
3. Mantenha o dispositivo na posição vertical para evitar desfazer a armadilha de micropartículas. Consulte a Figura 1B para obter um resumo do processo de formação de armadilhas de micropartículas.

3. Imunoensaio

1. Preparação de nanopartículas
   1. Tomar 2 μL da suspensão de nanopartículas de 100 nm previamente conjugadas com lisozima (modelo de antígeno). Adicione-o a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com 100 μL de solução de bloqueio. Incubar durante a noite a 4 °C.
   2. Adicione 150 μL de tampão de lavagem (1x TBS, 0,05% Tween 20).
   3. Coloque o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL em um separador magnético. Manter por 15 min para permitir a separação das nanopartículas (Figura 2).
      nota: O volume mínimo para o separador magnético é de 200 μL. Evite usar um volume menor.
   4. Remova o líquido do tubo com uma micropipeta. Evite o contato com a parede do tubo onde o pellet de nanopartículas foi formado.
   5. Adicione 250 μL de tampão de lavagem recente. Mantenha o tubo sob agitação por 15 min.
   6. Repita os passos 3.1.3.-3.1.5. 2x mais, agitando apenas por 5 min.
   7. Adicione a concentração desejada de anticorpo antilisozima primário (consulte a Tabela de Materiais). Ajuste para um volume final de 100 μL em diluente de anticorpos (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
   8. Incube por 15 min a 37 °C. Continue agitando por mais 15 min em temperatura ambiente.
   9. Repita as etapas de lavagem 3.1.2.-3.1.6.
   10. Adicione 100 μL de diluente de anticorpos. Adicionar o anticorpo secundário acoplado à peroxidase de rábano (HRP-AbII) (ver Tabela de Materiais) a uma diluição de 1:500.
   11. Repita as etapas de lavagem 3.1.2.-3.1.6.
   12. Manter as nanopartículas em um volume final de 50 μL de diluente de anticorpo.

4. Montagem experimental

1. Encha as duas seringas de vidro de 100 μL com água, conecte uma mangueira de 6,5 cm de comprimento a cada seringa, insira um pino de metal na extremidade da mangueira e coloque ambas as seringas na bomba de seringa controlada por computador.
2. Sele todas as mangueiras do dispositivo de acrílico com calor.
3. Corte a mangueira de entrada e mantenha apenas alguns milímetros. Encha a agulha dispensadora com tampão de lavagem e insira-a na mangueira cortada. Deixe a solução pingar antes de conectar a agulha ao dispositivo para evitar o acesso de ar ao dispositivo.
4. Corte a mangueira de saída do canal lateral. Conecte à bomba de seringa. Em seguida, execute o mesmo procedimento para a mangueira de saída do canal principal.
   nota: É fundamental executar as etapas 4.3.-4.4. nesta ordem para evitar desempacotar a armadilha de micropartículas. Se possível, verifique o estado da armadilha durante essas etapas com a ajuda de uma lupa.
5. Coloque uma lâmina de vidro no microscópio stage. Prenda o ímã à lâmina com fita dupla-face e coloque um pequeno pedaço de fita de cada lado para fixar as bordas do chip no vidro.
6. Defina uma vazão de 50 μL/h nas guias Taxa de vazão e Unidades no controlador da bomba de seringa. Selecione o modo de retirada e clique no botão Iniciar para ativar o fluxo do tampão de lavagem.
7. Com cuidado, aproxime-se do dispositivo em direção à corrediça com o ímã de maneira horizontal, de modo que a área do chip que contém a armadilha entre em contato com o ímã.
8. Cole as bordas do dispositivo no vidro com fita dupla-face para evitar movimentos. Evite obstruir o caminho óptico para microscopia (Figura 1C).

5. Imunodetecção

1. Mantenha o tampão de lavagem fluindo por 10 min a 50 μL/h para remover o excesso de BSA.
2. Remova o tampão de lavagem restante da agulha dispensadora com uma micropipeta. Adicione 50 μL da suspensão de nanopartículas.
3. Flua a suspensão de nanopartículas por 7 min a uma taxa de fluxo de 100 μL / h. Em seguida, altere a vazão para 50 μL/h e escove por mais 15 min.
4. Troque a agulha de distribuição. Flua o tampão de lavagem por 10 min a 50 μL/h. Prepare o substrato fluorogênico de acordo com as especificações do fabricante durante a etapa de lavagem.
5. Remova o tampão de lavagem restante da agulha dispensadora com uma micropipeta. Adicione 100 μL do substrato fluorogênico (consulte a Tabela de Materiais). Flua o substrato fluorogênico por 6 min a 50 μL / h.
6. Defina os parâmetros de medição de vazão (1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h e 10 μL/h) e tempo (6 min) nas guias de vazão e temporizador correspondentes da interface que controlam a bomba de seringa. Certifique-se de selecionar o modo de retirada para cada uma das medições a serem realizadas.
7. Defina uma guia de taxa de fluxo adicional em 50 μL/h e defina o temporizador em 3 min para a etapa de lavagem.
8. Ligue a fluorescência do microscópio 15 s antes que o substrato pare a 50 μL/h. Inicie a captura de imagem com o software da câmera do microscópio 10 s antes que o substrato pare com um tempo de exposição de 1.000 milissegundos. Realize imagens por 6 min a 1 quadro/s (FPS).
9. Clique no botão Iniciar do parâmetro de vazão desejado imediatamente após a parada da vazão de lavagem do substrato a 50 μL/h. Clique no botão Iniciar do fluxo de lavagem (50 μL/h) imediatamente após a interrupção do fluxo de medição selecionado.
10. Pare a captura da imagem e desligue a fluorescência do microscópio para evitar o fotobranqueamento do substrato.
11. Repita as etapas 5.8.-5.10. para cada vazão de medição usada.

Resultados

Figura 1: Configuração final do dispositivo. (A) Dispositivo de acrílico com as mangueiras conectadas às entradas e saídas correspondentes. A escala mostra as dimensões do dispositivo em centímetros. (B) Protocolo para a formação da armadilha de micropartículas. As micropartículas fluem através do canal por gravidade quando o dispositivo é colocado na posição vertica...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Micropartículas de ferro carbonílico	Sigma-Aldrich	Nº 44890	7 μm
clorofórmio	Fermont	Nº 6201	Risco à saúde: Moderado Inflamabilidade: Nenhuma Reatividade: Nenhum Perigo de contato: Moderado
Momento da câmera CMOS	Teledyne Photometrics		Tecnologia de sensores: CMOS Eficiência quântica: 73% Tamanho do pixel: 4,5 μm x 4,5 μm Interfaces suportadas: USB 3.2 Gen 2
Dr Gravar Software	Corporação Roland DGA		Software de gravação para projetar e criar o caminho de gravação na superfície
Exaustor	desconhecido	desconhecido
Tubulação plástica flexível	Tygon	AAD04103	ID = 0,020, OD = 0,060
Microsope de fluorescência	Zeiss	Axio Vert.A1
Agulha de distribuição de alta precisão	Loctite	Rolamento 98612
Rack de separação MagJET	Termocientífica		12 x 1,5 mL
Polimetilmetacrilato - Folha - PMMA, Acrílico	Goodfellow	ME303018/1	Espessura: 1,3 mm, Transparência: Claro/Transparente
Software PVCamTest	Teledyne Photometrics	Versão 3.10.107	Software de aquisição de imagens
Microscópio estéreo	Nikon	SMZ 7457
Grânulos de carboxila SuperMag	Oceano NanoTech	KSC0100	100 nm
Bomba de seringa	kd Científico	KDS200	Pode conter até duas seringas
Banho utrasônico	Branson	2800
Software VPanel	Sistema operacional Windows	Versão 1.0.3.0	Software para controlar a microfresadora