Um método baseado em imunofluorescência para quantificar o estresse de replicação em células cancerígenas

Abstract

Fonte: Ramakrishnan, N. et al., Quantificando o estresse de replicação em células de câncer de ovário usando imunofluorescência de DNA de fita simples.J. Vis. Exp. (2023)

O vídeo demonstra uma abordagem baseada em imunofluorescência para quantificar o estresse de replicação em células cancerígenas. As células tratadas com hidroxiureia produzem DNA de fita simples, detectado por imunofluorescência. A contagem de focos de fluorescência verde indica o nível de estresse de replicação nas células cancerígenas.

Protocol

NOTA: A linha celular de câncer de ovário, OVCAR3, foi usada nessas etapas, mas este protocolo é amplamente aplicável a várias outras linhagens celulares, incluindo aquelas derivadas de fontes não ovarianas. Um esquema do protocolo é mostrado na Figura 1.

1. Revestimento das células

1. Faça lamínulas revestidas de poli-L-lisina.
   1. Adicione lamínulas autoclavadas de 12 mm de diâmetro a um tubo cônico de 50 mL com solução de poli-L-lisina e coloque em um balancim por 15 min.
   2. Aspirar a solução numa capa de cultura de tecidos. Lave as lamínulas adicionando água estéril e coloque o tubo contendo as lamínulas de volta no balancim por 5 min. Repita esta etapa de lavagem três vezes.
   3. Espalhe as lamínulas revestidas em um prato estéril e aspire a água restante. Deixe as lamínulas secarem na capa de cultura de tecidos por 1 h ou até que não haja mais gotas de água. Depois de seco, feche o prato com parafilme e coloque a 4 °C.
2. Coloque uma lamínula revestida com poli-L-lisina em cada poço de uma placa de 24 poços. O uso de lamínulas de polilisina é fundamental para evitar o desprendimento das células das lamínulas durante a etapa de pré-extração.
3. Tripsinize as células OVCAR3 assim que atingirem 70% -80% de confluência.
   1. Para tripsinizar uma placa de cultura de 10 cm que é 70%-80% confluente, aspire o meio da placa e lave com 5-7 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   2. Aspire o PBS, adicione 1 mL de tripsina a 0,25% e coloque o prato em uma incubadora a 37 ° C por 8 a 10 minutos ou até que as células se decolem do fundo da placa.
   3. Colete as células com 5-10 mL de meio e adicione a um tubo cônico.
   4. Conte as células manualmente com um hemocitômetro usando procedimentos padrão.
4. Faça uma diluição de 25.000 células/mL e adicione 1 mL das células em lamínulas de poli-L-lisina colocadas nos poços das placas de 24 poços. Para qualquer outra linhagem celular, determine um número tal que as células sejam cerca de 70% a 80% confluentes após três duplicações populacionais.
5. Cultive as células no meio de cultura em condições padrão.

2. Células pulsantes com IdU

1. Para que as células se espalhem adequadamente nas lamínulas, basta dobrar a população. Após uma duplicação da população, pulse as células com 10 μM de 5-iodo-2'-desoxiuridina (IdU) (consulte a Tabela de Materiais sobre como reconstituir a IdU) para as duas duplicações populacionais subsequentes.
   nota: Tentamos diferentes análogos da timidina, incluindo bromodeoxiuridina (BrdU), 5-cloro-2′-desoxiuridina (CIdU) e IdU. Entre os três análogos, o IdU oferece a melhor relação sinal-ruído. Imagens comparativas de células pulsadas com os três análogos diferentes são mostradas na Figura 2. Recomendamos o uso de dois controles negativos: (i) uma amostra pulsada sem IdU e (ii) um controle de anticorpos primários. Se a formação de ssDNA precisar ser avaliada devido a um determinado tratamento, recomendamos adicionar o medicamento após a primeira rodada de duplicação de IdU.
2. Depois de pulsar com IdU por duas duplicações populacionais, colha as células para imagens.
   1. Substitua o meio por PBSTx 0,5% gelado (PBS + 0,5% Triton X-100) no gelo por 5 min. Esta etapa de pré-extração ajuda a liberar proteínas citoplasmáticas e não ligadas à cromatina, deixando intactas as proteínas ligadas à cromatina. Certas linhas celulares podem se desprender facilmente durante a pré-extração. Em tal cenário, pode-se usar tampão CSK a 0,5% (10 mM PIPES (pH 6,8), 100 mM de cloreto de sódio (NaCl), 300 mM de sacarose, 3 mM de cloreto de magnésio (MgCl₂), 1 mM de ácido etilenoglicol tetracético (EGTA) e 0,5% de Triton X-100).

3. Fixação

1. Aspire PBSTx e incube por 15 min com paraformaldeído (PFA) a 3% (Tabela de Materiais) em temperatura ambiente, seguido de três a quatro lavagens com 1x PBS. As células fixas podem ser mantidas a 4 °C até novas etapas.
   CUIDADO: O PFA é altamente tóxico e cancerígeno. Evite o contato com a pele, olhos e membranas mucosas. Execute todas as etapas com PFA em uma capela e descarte os materiais adequadamente.

4. Permeabilização e bloqueio

1. Após a fixação, permeabilize as células usando PBSTx a 0,5% em gelo por 5 min. Use volume suficiente para cobrir toda a lamínula (normalmente entre 500 μL e 1 mL).
2. Lave as células três a quatro vezes com 0,2% de PBST (1X PBS + 0,2% Tween-20) em temperatura ambiente. Um mL de PBST é suficiente para lavar cada poço. Realize as lavagens consecutivas sem incubações.
3. Aspirar o PBST e bloquear as amostras utilizando albumina de soro bovino a 5%, BSA (Table of Materials) confeccionada em 1x PBS (tampão bloqueador) por 30 min em temperatura ambiente.

5. Imunocoloração com o anticorpo IdU

1. Para imunocoloração, prepare uma câmara umidificada (toalha de papel molhada em um Tupperware de fundo plano). Cubra a tampa da placa de 24 poços com parafilme, coloque na câmara umidificada e coloque as lamínulas na tampa da placa.
2. Preparar o anticorpo primário de ratinho anti-BrdU (Tabela de Materiais) diluindo-o a 1:200 no tampão de bloqueio do passo 4.2. O anticorpo anti-BrdU já demonstrou detectar IdU.
3. Adicione 60 μL de diluição de anticorpos IdU na parte superior das lamínulas. Incubar as lamínulas durante 1 h a 37 °C.
   1. Em alternativa, utilize menos solução de anticorpos se as lamínulas forem lançadas sobre uma gota (20-25 μL) de diluição de anticorpos a 1:200 pipetada para o parafilme. Isso também diminui a probabilidade de a solução secar durante a incubação.
4. Após a incubação de 1 h, aspirar o anticorpo primário. Retorne as lamínulas de volta para uma placa de 24 poços e lave-as quatro vezes com 0,2% de PBST.
5. Para o anticorpo secundário, use a mesma câmara umidificada descrita na etapa 5.1. Diluir o anticorpo secundário conjugado com ratinho (Tabela de Materiais) no tampão de bloqueio (1:200). Adicione 60 μL de anticorpo secundário às lamínulas e incube à temperatura ambiente no escuro por 1 h. Este anticorpo secundário é sensível à luz.
6. Aspire o anticorpo secundário. Retorne as lamínulas de volta à placa de 24 poços e lave quatro vezes com 0,2% de PBST.
7. Etiquete as lâminas do microscópio e monte as lamínulas nas lâminas com meio de montagem de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Tabela de Materiais). Armazene as lâminas no escuro em temperatura ambiente por 24 horas. A incubação de 24 h é recomendada se o meio de montagem precisar ser curado ou endurecido.
   nota: As lâminas podem então ser armazenadas a 4 °C antes de serem fotografadas em um microscópio de fluorescência. Uma imagem representativa é mostrada na Figura 3.

Results

Figura 1: Esquema de rotulagem IdU.As células são pulsadas com IdU para duas duplicações populacionais. Se algum tratamento medicamentoso for necessário, ele deve ser administrado após a primeira duplicação da população na presença de IdU.

Figura 2: Comparação ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% de paraformaldeído (PFA)	Fisher Científico	NC0179595	10 g de sacarose + 100 mL 10X PBS + água para fazer o volume de 925 mL. Adicione 75 mL de PFA livre de metanol a 40%, misture e faça alíquotas de 50 mL antes do armazenamento Armazenamento: Armazenar em -20 °C
5-iodo-2'-desoxiuridina (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354,10 g/mol. Para estoque de 10 mM: dissolver 3,541 mg de IdU em 1 mL de amônia líquida 1 N
Anticorpo anti-BrdU	BD Biociências	Rolamento 347580	Armazenamento: Armazenar em 4 °C
Anticorpo secundário anti-mouse Alexa Fluor Plus 488	Thermo Científico	Rolamento A32766	Sensível à luz - mantenha no escuro
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Feito adicionando massa específica ao volume de PBS Armazenamento: Armazenar em 4 °C
Vidro de cobertura circular	Ciências da Microscopia Eletrônica	72230-01
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Meios de Crescimento: RPMI suplementado com L-glutamina, 0,01 mg/mL de insulina bovina; soro fetal bovino até uma concentração final de 20% e 1X Pen Strep Armazenamento: Meios de congelamento: meio de crescimento + 5% DMSO e armazenado em -80 °C
Solução de poli-L-lisina	Sigma Aldrich	Pág. 4832-50ML	Armazenamento: Armazenar em 4 °C
ProLong Diamond Antifade Mountant com DAPI	Thermo Científico	Pág. 36962	Armazenamento: Armazenar em 4 °C
Tripsina-EDTA, 0,25%	Genesee Científico	25-510	Armazenamento: Armazenar em 4 °C
Água filtrada estéril	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Armazenamento: Armazenar em 4 °C