Uma tecnologia Snap Chip para um imunoensaio sanduíche multiplexado livre de reatividade cruzada

Resumo

Fonte: Li, H. et al., Snap Chip para imunoensaios sanduíche multiplexados sem reatividade cruzada e sem Spotter.J. Vis. Exp. (2017)

O vídeo mostra a implementação da tecnologia de chip instantâneo para imunoensaios sanduíche multiplexados sem reatividade cruzada. A simples ação de encaixar duas lâminas de microarray, cada uma contendo reagentes diferentes, garante a transferência de reagentes sem contaminação cruzada e ajuda a detectar várias proteínas usando imunoensaio sanduíche.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Fabricação e armazenamento de chips de pressão

1. Método de transferência simples (figura 1a)
   1. Soluções de cAb spot contendo anticorpos de 400 μg/mL e 20% de glicerol em solução salina tamponada com fosfato (PBS) em uma lâmina de ensaio de nitrocelulose (ou vidro funcionalizado) com um observador de microarray a jato de tinta a uma umidade relativa de 60% (1,2 nL para cada ponto) com espaçamento de centro a centro de 800 μm. Certifique-se de que o slide esteja fixado no deck do observador de acordo com um canto (aqui, o canto inferior esquerdo foi usado).
   2. Incube a lâmina de ensaio manchada à temperatura ambiente por 1 h com umidade relativa de 60%.
   3. Prenda uma junta do módulo deslizante com 16 compartimentos na lâmina de ensaio para dividi-la em 16 poços. Enxágue a lâmina três vezes adicionando 80 μL de PBS contendo 0,1% de Tween-20 (PBST) em cada poço e agitando a 450 rpm em um agitador, 5 min de cada vez.
   4. Adicione 80 μL de soluções de bloqueio a cada poço e agite por 1 h a 450 rpm.
   5. Remova a junta e seque a lâmina de ensaio com um jato de nitrogênio.
   6. Fixe uma corrediça de transferência no deck de observação e empurre o canto inferior esquerdo da lâmina contra o canto inferior esquerdo do deck de observação. O jato de tinta detecta uma série de marcas de alinhamento (uma solução de microesferas de poliestireno) com o mesmo layout dos anticorpos de captura (cAbs).
   7. Deixe as marcas de alinhamento secarem. Vire a corrediça de transferência e coloque-a de volta no deck do observador, fixando-a no canto inferior esquerdo.
   8. Prepare as soluções de detecção de anticorpos (dAb) contendo 20 μg/mL de anticorpos, 20% de glicerol e 1% de albumina de soro bovino (BSA).
   9. Usando a câmera do observador, tire uma foto de uma marca de alinhamento. Implemente esta imagem no programa de detecção como um fiducial e obtenha o sistema de reconhecimento de imagem do observador a jato de tinta para identificar a marca superior esquerda. Use sua coordenada como o primeiro ponto da matriz dAb. Spot 8 nL por gota com um espaçamento de centro a centro de 800 μm.
2. Método de transferência dupla (Figura 1b)
   1. Coloque um slide de transferência 1 no deck do observador de jato de tinta no canto inferior esquerdo. Localize soluções de cAbs contendo anticorpos de 400 μg/mL, 20% de glicerol e 1% de BSA em PBS na lâmina com um observador de microarray a jato de tinta a uma umidade relativa de 60% (0,4 nL para cada ponto e ~ 200 μm de diâmetro). O espaçamento entre centros é de 400 μm.
   2. Encaixe a lâmina de transferência com uma lâmina de ensaio revestida de nitrocelulose (ou vidro funcionalizado) usando um aparelho de encaixe (Figura 2) para transferir as gotículas de cAb para a lâmina de ensaio.
      1. Gire todos os seis botões na lateral do aparelho de encaixe em 90 graus para puxar e travar todos os êmbolos na posição aberta. Insira a corrediça de transferência no suporte da corrediça em seu receptáculo com o canto cortado voltado para o pino pogo fixo. Gire o primeiro conjunto de três botões para liberar os êmbolos com o pino pogo dourado e certifique-se de que os slides estejam empurrados contra os pinos de alinhamento.
      2. Insira uma lâmina revestida de nitrocelulose no aparelho de encaixe de cabeça para baixo nos 4 pinos pogo. Gire o segundo conjunto de três botões para liberar os êmbolos com o pino prateado e certifique-se de que os slides estejam empurrados contra os pinos de alinhamento.
      3. Feche o aparelho de encaixe colocando o invólucro superior no suporte deslizante usando os pilares e orifícios de alinhamento para um posicionamento preciso.
      4. Insira o aparelho de encaixe fechado em sua gaiola e empurre a aba de fechamento completamente para baixo para colocar os microarrays frente a frente enquanto aplica a pressão apropriada. Mantenha fechado por 1 min.
   3. Separe os slides. Incubar a lâmina de ensaio à temperatura ambiente durante 1 h com uma humidade relativa de 60%. Lave, bloqueie e seque a lâmina de ensaio conforme descrito nas etapas 1.1.3 - 1.1.5.
   4. Coloque outra lâmina de transferência na plataforma do observador a jato de tinta e empurre contra o canto inferior esquerdo. Soluções spot de dAb contendo 50 ou 100 μg / mL de anticorpos (ver Tabela 1), 20% de glicerol e 1% de BSA em PBS. Certifique-se de que cada ponto tenha 0,8 nL e que o espaçamento entre os pontos seja de 400 μm.
   5. Armazene o ensaio e a lâmina de transferência. Selar as lâminas de ensaio e de transferência num saco hermético contendo exsicante e colocar num congelador a -20 °C.

2. Imunoensaios multiplexados com chips de encaixe

1. Retire a lâmina de ensaio do freezer. Deixe o saco lacrado por 30 min até que a lâmina atinja a temperatura ambiente.
2. Prepare soluções de amostra diluídas em série de 7 pontos por meio de proteínas em PBS contendo 0,05% de Tween-20.
   nota: Aqui, um fator de diluição de 5 vezes é usado. As concentrações iniciais para cada proteína estão listadas na Tabela 1.
3. Prepare soluções de amostra conforme apropriado. Por exemplo, dilua o soro humano 4 vezes em tampão PBST.
4. Prenda uma junta de 16 compartimentos na lâmina do ensaio.
5. Encher uma coluna de 8 alvéolos com as 7 soluções de diluição de proteínas e uma solução tampão PBST isenta de proteínas por pipetagem. Pipetar as soluções de amostra nos outros 8 alvéolos na mesma lâmina.
   NOTA: Soluções de 80 μL podem ser encaixadas em cada poço. Mais lâminas podem ser usadas para medir amostras adicionais quando necessário.
6. Incubar as amostras num agitador a 450 rpm, durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C. Lavar a lâmina três vezes com PBST no agitador a 450 rpm, 5 min de cada vez. Remova a junta e seque a lâmina sob uma corrente de gás nitrogênio.
7. Recupere a corrediça de transferência com dAbs do freezer. Mantenha o saco lacrado por 30 min em temperatura ambiente. Em seguida, incube a lâmina em uma câmara fechada (por exemplo, caixa de pontas vazia) contendo 60% de esferas de estabilização de umidade por 20 min para reidratação.
8. Encaixe a lâmina de transferência com a lâmina de ensaio usando um aparelho de encaixe (Figura 2) para transferir as gotículas de dAb. Consulte o ponto 1.2.2 para o funcionamento do aparelho de encaixe.
9. Separe os slides. Incubar a lâmina de ensaio numa câmara fechada contendo 60% de esferas de estabilização de humidade durante 1 h. Prenda a lâmina de ensaio com uma junta de 16 compartimentos e enxágue a lâmina 4 vezes usando PBST em um agitador a 450 rpm, 5 min de cada vez.
10. Pipetar 80 μL de soluções contendo 2,5 μg/ml de fluoróforo de estreptavidina em PBS em cada alvéolo. Incubar durante 20 min num shaker a 450 rpm.
11. Enxágue a lâmina 3 vezes com PBST e uma vez com água destilada no shaker a 450 rpm. Remova a junta e seque a lâmina com gás nitrogênio.

3. Digitalização de slides e análise de dados

1. Digitalize a lâmina do ensaio com um scanner de microarray de fluorescência usando o laser de 635 nm.
2. Extraia a intensidade líquida de cada ponto usando um software de análise (por exemplo, analisador array-pro).
3. Calcule o limite de detecção (LOD) de cada proteína usando um software estatístico e determine as concentrações de proteína nas amostras.
   nota: O LOD é definido como a interceptação Y da curva padrão incrementada em três vezes o desvio padrão de três ensaios independentes.

Tabela 1. Concentrações de proteínas e LODs no tampão do ensaio de 50 plex. O LOD para CA 15-3 está em U/ml (*).

Nome da proteína	Concentração inicial (ng/ml)	LOD (pg/ml)	Nome da proteína	Concentração inicial (ng/ml)	LOD (pg/ml)
ANG2	500	1.3 × 104	IL-6b	1	2.1 × 102
BDNF	500	1.0 × 102	IL-5	50	77
CA 15-3*	1	4.9 × 103	IL-4	1000	1.5 × 104
Cea	1000	5.4 × 103	IL-2	50	76
CXCL10/IP-10	50	1.7 × 102	Lep	200	4.0 × 102
Crp	200	44	Mig	500	11 × 102
Eng	1000	6.2 × 102	CCL3/MIP-1α	50	3.3
FEG	50	1.8 × 102	CCL4/MIP-1β	50	12
EGFR	200	1.9 × 102	MMP-3	500	1.0 × 102
FAS-L	500	4.5 × 102	M-CSF	500	8.2 × 103
FGF	500	1.0 × 103	MMP-9	200	3.1 × 102
G-CSF	500	39	CCL2/MCP-1	50	55
GM-CSF	50	3.8	NCAM-1	500	1.7 × 103
GRO-α	50	3.0 × 102	β-NGF	200	1.4 × 103
HER2	500	3.5 × 103	NT-3	200	5.8 × 102
PDGF-BB	200	73	OPN	500	1.9 × 103
IL-1β	500	7.9 × 102	RBP4	200	1.2 ×102
IL-1ra	200	1.1 × 103	Sparc	1000	4.6 ×104
IL-15	50	8,2 × 102	TNF-α	50	4.4
IL-12	1	30	TNF-RI	50	1,3 × 102
IL-11	500	1.2 × 103	TNF-RII	50	12
IL-10	500	6.1 ×102	FAS/TNFRSF6	200	2,8 ×102
IL-8	50	6.6	uPA	200	24
IL-7	2.5	26	uPAR(CD87)	200	76
IL-6a	1000	84	VEGF	200	6,7 × 102

Resultados

Figura 1. Esquema do procedimento de ensaio comparando (a) métodos de transferência simples e (b) dupla.

Figura 2. Esquema mostrando diferenças entre transferência simples e dupla.a) O espelhamento dos reagentes de transferência amplifica o desalinhame...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Comprimido de solução salina tamponada com fosfato	Fisher Científico	Rolamento 5246501EA
Cy5 conjugado com estreptavidina	Rockland	S000-06
Interpolação-20	Sigma-Aldrich	pág. 1379
Albumina de soro bovino	Laboratórios Jackson ImmunoResearch, Inc	001-000-162
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
Solução de bloqueio: Estabilizador de Microarray StabilGuard Choice sem BSA	SurModics, Inc	SG02
Lâminas revestidas com nitrocelulose	Graça Bio-Laboratórios, Inc	305116
Lâminas revestidas com aminosilano	Schott América do Norte	1064875
Dispositivo de encaixe	Parallex BioAssays Inc.	PBA-SD01
Spotter do microarray do Inkjet	GeSiM	Nanoplotter 2.0
Junta do módulo deslizante	Graça Bio-Laboratórios, Inc	204862
Grânulos de estabilização de umidade	Parallex BioAssays Inc.	PBA-HU60
Software Array-Pro Analyzer	Cibernética da mídia	Versão 4.5
Varredor do microarray da fluorescência	Agilent	Scanner de microarray SureScan
Software de bioestatística	Software GraphPad	GraphPad Prisma 6
Anticorpo de captura de endoglina	Sistemas de P&D	MAB10972
Proteína endoglina	Sistemas de P&D	1097-PT
Anticorpo de detecção de endoglina	Sistemas de P&D	BAF1097
IL-6a (ver Tabela 1)	Sistemas de P&D
IL-6b (ver Tabela 1)	Invitrogen