Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Coloração com o primeiro anticorpo
- Desparafinar e reidratar lâminas embebidas em parafina fixadas em formalina (FFPE) com 5 min alocados para cada uma das seguintes etapas: xileno ou reagentes equivalentes 3x, etanol 100% 2x, etanol 95% 1x, etanol 70% 1x, etanol 50% 1x e água destilada 2x.
nota: As lâminas devem permanecer úmidas a partir desta etapa de reidratação até a montagem na etapa final.
- Para a recuperação opcional do antigénio, colocar as lâminas em 275 ml de solução de citrato de sódio a ferver (10 mM, pH = 6,0) durante 8 min. Para manter a solução fervendo, coloque as lâminas planas no fundo de uma caixa de ponteira de pipeta de14 x 9.5 x 9 cm 3 (L x C x A) com tampa e leve ao micro-ondas a 70% da potência em um forno de micro-ondas de 700 W por 8 min. Em seguida, retire a caixa de pontas de pipeta do forno de micro-ondas, abra a tampa e deixe a solução esfriar em temperatura ambiente (RT) por pelo menos 20 min.
- Transfira as lâminas para um frasco Coplin contendo PBST (solução salina tamponada com fosfato com 0,1% de polissorbato 20/80). Lave com PBST por 5 min 3x. Se não passar imediatamente para a próxima etapa, armazene as lâminas nesta etapa com PBST em um frasco Coplin em RT por algumas horas ou a 4 ° C por 1-2 dias, se não passar imediatamente para a próxima etapa.
- Para preparar a solução de bloqueio, use o soro normal da espécie hospedeira do anticorpo secundário como reagente de bloqueio. Outros reagentes de bloqueio comerciais também podem ser usados. Se estiver usando soro normal empregado para o estudo apresentado neste estudo, adicione 100 μL de soro de burro normal a 4,9 mL de PBST. A solução de bloqueio pode ser armazenada a 4 °C por até 3 dias.
- Para bloquear, sacuda o PBST das lâminas e cubra-as rapidamente com solução de bloqueio suficiente. Incubar as lâminas em RT em uma câmara umidificada por 30 min.
- Preparar a solução de anticorpos primários (500 μL para duas lâminas) utilizando a solução de bloqueio para diluir o anticorpo primário até à concentração desejada. A solução deve ser conservada com gelo até à utilização.
- Para a 3β-hidroxiesteróide desidrogenase (3βHSD), adicione 2 μL de anticorpo 3βHSD a 498 μL de solução de bloqueio.
- Para tirosina hidroxilase (TH), adicione 0,5 μL de anticorpo TH em 499 μL de solução de bloqueio.
- Para β-catenina, adicione 1 μL de anticorpo β-catenina a 499 μL de solução de bloqueio.
- Para 20α-hidroxiesteróide desidrogenase (20αHSD), adicione 1 μL de anticorpo 20αHSD em 499 μL de solução de bloqueio.
- Para o citocromo P450 2F2 (CYP2F2), adicione 2 μL de anticorpo CYP2F2 a 498 μL de solução de bloqueio.
- Incube com o anticorpo primário sacudindo a solução de bloqueio das lâminas e cobrindo-as rapidamente com solução de anticorpo primário suficiente. Incubar as lâminas numa câmara humidificada durante a noite a 4 °C. Durante a incubação, as lâminas podem ser cobertas por um pequeno pedaço de filme de parafina para evitar o ressecamento.
- Na manhã seguinte, lave as lâminas com PBST por 5 min 3x.
- Prepare a solução de anticorpo secundário (500 μL para duas lâminas) usando a solução de bloqueio para diluir o anticorpo secundário biotinilado até a concentração desejada (por exemplo, 1 μL de anticorpo anti-camundongo de burro ou anticorpo anti-coelho de burro em 499 μL de solução de bloqueio). A solução deve ser conservada com gelo até à utilização.
- Incubar com o segundo anticorpo sacudindo o PBST das lâminas e cobrindo-os rapidamente com uma solução de anticorpos secundários suficiente. Incubar as lâminas em uma câmara umidificada por 1 h em RT.
nota: Se a biotina endógena for uma preocupação, use um anticorpo secundário conjugado com peroxidase em vez do anticorpo secundário biotinilado. Pule para a etapa 1.14 se estiver usando um anticorpo secundário conjugado com peroxidase na etapa 1.10.
- Lave as lâminas com PBST por 5 min 3x.
- Prepare a solução de estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano (SA-HRP) (500 μL para duas lâminas) adicionando 0,5 μL de SA-HRP a 499 μL de PBS. A concentração final é de 1 μg/mL.
- Incubar com a solução SA-HRP. Sacuda o PBST das lâminas e cubra rapidamente as lâminas com solução SA-HRP suficiente. Incubar as lâminas em uma câmara umidificada por 0,5 h em RT.
- Lave as lâminas com PBST por 5 min 3x.
- Prepare a solução de fluoróforo-tiramida diluindo fluoróforo-tiramida com seu tampão de diluição de acordo com as instruções do fabricante (por exemplo, 5 μL de fluoróforo-tiramida em 496 μL de tampão de diluição).
- Execute o desenvolvimento do sinal com fluoróforo-tiramida sacudindo o PBST das lâminas e cobrindo rapidamente as lâminas com solução suficiente de fluoróforo-tiramida. Incubar em câmara umidificada por 1 min em RT. O tempo de incubação pode ser ajustado para obter a intensidade de fluorescência desejada. Pare a reação transferindo as lâminas para um frasco Coplin contendo PBST. Lave as lâminas com PBST por 3 min 2x.
- Os sinais podem ser verificados rapidamente em um microscópio de fluorescência para confirmar o resultado nesta fase. Se as lamínulas não estiverem sendo usadas, aplique uma gota de glicerol: PBS (1: 1) em cada seção para manter as amostras úmidas. Lave as lâminas com PBST por 3 min 2x. As lâminas podem ser armazenadas em PBST a 4 °C durante alguns dias antes de passarem para a fase seguinte.
2. Retire o primeiro anticorpo
- Coloque as lâminas em 275 mL de solução de citrato de sódio fervente (10 mM, pH = 6,0) por pelo menos 8 min. Mantenha a solução fervendo colocando as lâminas planas no fundo de uma caixa de ponteiras de pipeta de 14 x 9,5 x 9 cm3 (L x C x A) com tampa e leve a solução ao micro-ondas com 70% da potência em um forno de micro-ondas de 700 W por 8 min. Se preferir um tempo de decapagem mais longo, pode ser necessário completar o tampão usando uma solução de citrato de sódio fervente para manter as lâminas imersas em solução tampão o tempo todo. Retire a caixa de pontas da pipeta do forno de micro-ondas, abra a tampa e deixe a solução esfriar em RT por pelo menos 20 min.
- Transfira as lâminas para um frasco Coplin contendo PBST. Lave com PBST por 5 min 3x. Se a próxima etapa não for realizada imediatamente, armazene as lâminas em um frasco Coplin com PBST em RT por algumas horas ou a 4 ° C por 1-2 dias.
3. Corar com o segundo anticorpo
- Comece na etapa de bloqueio e siga os mesmos procedimentos na etapa 1.5 até a etapa 1.14. Nas etapas de desenvolvimento do sinal (etapa 1.15 e etapa 1.16), use o fluoróforo-tiramida em um espectro de fluorescência diferente.
nota: As lâminas podem ser removidas usando este método várias vezes para permitir a coloração multiplex. O último anticorpo não requer fluoróforo-tiramida como repórter. Um anticorpo secundário conjugado com fluoróforo pode ser usado para mostrar sinais do último anticorpo primário.
- Incubar as lâminas com 2 μg/mL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ou solução de Hoechst por 1 min em RT se for necessária contracoloração nuclear. Em seguida, lave as lâminas com PBST por 3 min 2x.
