Um método de imunocoloração multiplex usando anticorpos primários da mesma espécie hospedeira

Abstract

Fonte: Lyu, Q., et al. Microwaving e fluoróforo-tiramida para imunocoloração multiplex em supra-renais de camundongos - usando anticorpos primários não conjugados da mesma espécie hospedeira. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra um ensaio para realizar imunocoloração multiplex usando anticorpos primários da mesma espécie hospedeira. Neste método, uma seção de tecido adrenal passa por um processo de imunocoloração em duas etapas. Inicialmente, a seção é corada com anticorpos específicos para marcadores no córtex, seguida pela remoção do anticorpo ligado e recoloração com anticorpos específicos para marcadores na medula.

Protocol

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Coloração com o primeiro anticorpo

1. Desparafinar e reidratar lâminas embebidas em parafina fixadas em formalina (FFPE) com 5 min alocados para cada uma das seguintes etapas: xileno ou reagentes equivalentes 3x, etanol 100% 2x, etanol 95% 1x, etanol 70% 1x, etanol 50% 1x e água destilada 2x.
   nota: As lâminas devem permanecer úmidas a partir desta etapa de reidratação até a montagem na etapa final.
2. Para a recuperação opcional do antigénio, colocar as lâminas e....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Meio de montagem antidesbotamento	Laboratórios de vetores	H-1000
Anti-rato de burro biotinilado	JacksonImmuno	715-066-151	Diluição 1:500
Anti-coelho de burro biotinilado	JacksonImmuno	711-066-152	Diluição 1:500
DAPI	BioLegend	422801	2 μg/ml em água destilada
Microscópio de fluorescência	eco	Revolução 4
Estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano	JacksonImmuno	016-030-084	Diluição 1:1000
Forno de micro-ondas, 700W	General Electric	JEM3072DH1BB
Camundongo anti-CYP2F2	Santa Cruz	SC-374540	Diluição 1:250
Camundongo anti-TH	Santa Cruz	SC-25269	Diluição 1:1000
Soro de burro normal	JacksonImmuno	Telefone: 017-000-121	2% de soro no PBST
Coelho anti-20αHSD	Kerafast,	EB4002	Diluição 1:500
Coelho anti-3βHSD	transgênico	KO607	Diluição 1:250
Coelho anti-TH	Novus	NB300-109	Diluição 1:1000
Coelho anti-β-catenina	Abcam,	AB32572	Diluição 1:500
Peroxidase de Rábano Estreptavidina (SA-HRP)	JacksonImmuno	Telefone: 016-303-084	Diluição 1:1000
TSA Cy3 Tiramida	PerkinElmer	SAT704B001EA	Diluição 1:100
TSA Fluoresceína Tiramida	PerkinElmer	SAT701001EA	Diluição 1:100