Imagem de imunofluorescência multiplexada para analisar subpopulações de células T resistentes à imunoterapia

Resumo

Fonte: Granier, C., et al. Análise de imunofluorescência multiplexada e quantificação de células T PD-1⁺ Tim-3⁺ CD8⁺ intratumorais. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra uma técnica de imagem multiespectral de fluorescência in-situ para analisar diferentes subpopulações de células T infiltrantes no tecido tumoral. Uma criossecção tecidual de carcinoma de células renais é tratada com anticorpos para marcar células T CD8+ que expressam receptores inibitórios específicos e exibem um fenótipo resistente à imunoterapia. A seção marcada é visualizada usando um microscópio multiespectral para identificar as subpopulações distintas de células T CD8+.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto

1. Coloração de imunofluorescência in situ de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs)

1. Diretrizes processuais
   1. Execute todas as etapas experimentais em temperatura ambiente.
   2. Para todas as etapas, execute as diluições com Tris Buffer Saline (TBS; consulte a Tabela de Materiais).
   3. Efectuar a lavagem em TBS para todas as etapas, excepto após a incubação do anticorpo primário. Para este último, use Tris Buffer Saline Tween20 (TBST, consulte a Tabela de Materiais). Para composição e reconstituição do buffer, consulte a Tabela 1.
   4. Use uma câmara de umidade para incubações de anticorpos e um frasco de coloração para lavar.
   5. Não deixe a seção secar durante o procedimento.
2. Pré-tratamento
   1. Descongele a lâmina que contém a amostra de tecido e seque cuidadosamente a lâmina ao redor da amostra com uma toalha de papel. Delimitar a área de reação que contém o tecido com uma caneta de barreira hidrofóbica (ver Tabela de Materiais). Seque por 2 min.
   2. Fixe as amostras em acetona 100% por 5 min, seque por 2 min e lave com TBS por 10 min.
3. Saturação e bloqueio
   1. Pré-trate as lâminas por 10 min com 3 gotas de avidina 0,1%, toque e/ou mova a lâmina para distribuir a avidina e remover as bolhas de ar e, em seguida, trate por 10 min com 3 gotas de biotina 0,01% (consulte a Tabela de Materiais), toque e/ou sacuda. Lave com TBS.
   2. Realize um bloqueio dos receptores Fc. Aplicar 100 μL de um volume de 5% / volume de soro normal diluído em TBS. Use soro da mesma espécie hospedeira que o anticorpo secundário ou terciário marcado (ver Tabela de Materiais); soro de burro foi usado aqui. Incubar por 30 min.
   3. Durante a incubação, gire brevemente os anticorpos anti-CD8, proteína de morte celular programada 1 (PD-1) e imunoglobulina de células T e proteína 3 contendo mucina (Tim-3) (Tabela de Materiais). Prepare a mistura de anticorpos primários em TBS conforme descrito na Tabela 2.
4. Imunocoloração para CD8, PD-1 e Tim-3
   1. Preparar a mistura de anticorpos primários. Consulte a Tabela de Materiais e a Tabela 2 para obter os anticorpos usados (anti-CD8, PD-1, Tim-3 e seus anticorpos secundários correspondentes) e suas concentrações.
   2. Toque e/ou agite o soro de burro restante (adicionado na etapa 1.3.2). Incube as lâminas com 100 μL da mistura de anticorpos primários não marcados por 1 h em uma câmara umidificada.
   3. Durante a incubação, gire brevemente os anticorpos anti-coelho Cyanine 5, Alexa Fluor 488-anti-goat e anti-camundongo biotinilado e prepare a mistura de anticorpos secundários conforme descrito na Tabela 2.
   4. Lave as lâminas em TBST por 5 min. Seque as lâminas.
   5. Incubar as lâminas com 100 μL dos anticorpos secundários durante 30 min numa câmara humidificada.
   6. Prepare a mistura de anticorpos terciários contendo cianina 3-estreptavidina, conforme descrito na Tabela 2.
   7. Lave as lâminas em TBS por 10 min. Seque as lâminas.
   8. Incubar as lâminas com 100 μL da mistura de anticorpos terciários durante 30 min.
   9. Lave as lâminas em TBS por 10 min. Seque as lâminas.
5. Montagem de células
   1. Monte as lâminas em um meio de montagem contendo 4',6-Diamidino-2-fenilindo, dicloridrato (DAPI) (1,5 μg/mL DAPI) com uma lamínula compatível para microscopia de fluorescência (ver Tabela de Materiais).
      nota: Como controle negativo para cada experimento, uma lâmina com anticorpos pareados por isotipo foi usada na mesma concentração que os anticorpos correspondentes. Para esta coloração, usamos anticorpos de controle negativos para IgG1 de camundongo, IgG de coelho e IgG de cabra (ver Tabela de Materiais). Como controle positivo, utilizou-se tonsila hiperplásica humana, sabidamente positiva para os marcadores testados, para cada experimento. Uma coloração típica é descrita nos resultados (Figura 1). A monocoloração de CD8, PD-1 e Tim-3 deve ser realizada individualmente (uma coloração por lâmina) com o mesmo pré-tratamento e sem DAPI. Deve também ser realizada uma lâmina nas mesmas condições experimentais, sem qualquer anticorpo e apenas um meio de montagem DAPI. Uma lâmina deve ser obtida em condições experimentais idênticas, sem qualquer anticorpo e sem DAPI.

2. Análise de fluorescência e contagem automatizada de células

1. Aquisição de imagens com o microscópio automatizado
   1. Crie um protocolo.
      1. Ligue o software do microscópio automatizado e o iluminador de fluorescência.
      2. Na barra de menu, clique em "Arquivo", "Criar protocolo", selecione "DAPI", "FITC" e "TRITC".
      3. Clique em "Avançar", "Seção de tecido" e clique em "Avançar", "Nome do protocolo". Escolha um nome, por exemplo, "CD8-PD-1-Tim-3", clique em "Avançar" e "Salvar".
      4. Coloque manualmente um slide no palco.
      5. Na barra de menus, clique em "configuração" e "configurações". Clique em "Definir Z inicial" na nova janela.
      6. Ajuste o tempo de exposição com uma lâmina de controle positivo, ou seja, um CD8, PD-1 e Tim-3 com coloração tripla com uma amostra DAPI.
      7. Na barra de controle, clique em "definir exposição".
      8. Ajuste o tempo de exposição para cada filtro até obter um sinal suficiente, mas não saturante.
      9. Para imagens monocromáticas, execute o seguinte:
      10. Selecione aquisição e, em 'foco automático', escolha o filtro DAPI.
      11. No "limite da área de varredura", mova a objetiva superior para o canto superior esquerdo do slide. Clique em "Marcar". Faça o mesmo para o canto inferior direito.
          nota: Esta etapa delimita a área de imagens de baixa potência (imagem LP) em 4X; Certifique-se de colocar bem a marca para envolver todas as amostras da série.
      12. Para imagens de alta potência (HP), execute o seguinte:
      13. Em 'Foco automático', escolha "DAPI".
      14. Na faixa "Aquisição", escolha "DAPI", "FITC", "Cy3" e "Cy5". Clique em "OK". Clique em "Arquivo" e "Salvar protocolo" na barra de menus.
   2. Digitalize os slides.
      1. Carregue o protocolo clicando em "Arquivo" e "Carregar protocolo" na barra de menus. Clique em "Iniciar".
      2. Digite 'Lab ID' (local da pasta para armazenamento de imagens). Insira a ID do slide para identificar o slide. Clique em "Avançar".
      3. Clique em "Imagem monocromática" (para digitalizar todo o slide sob luz de campo brilhante e adquirir imagens sequenciais usando uma objetiva 4x).
         nota: Isso produz uma visão geral em tons de cinza do slide.
      4. Clique em "Encontrar espécime". Selecione a área de tecido a ser escaneada em baixa resolução (4x): segure a tecla 'Ctrl' e clique em um campo usando o cursor para selecionar ou desmarcar campos (Figura 2A).
      5. Clique em "LP Imaging" (imagem 4x) para aquisição de imagem fluorescente Vermelho Azul Verde de cada campo.
      6. Para seleção de campo HP, mantenha pressionada a tecla 'Ctrl' e clique em um campo usando o cursor para selecionar ou desmarcar campos correspondentes à área do tecido que será digitalizada em alta resolução (20x). Selecione 5 campos (Figura 2B).
      7. Clique em "HP Imaging" (imagem 20x) para obter uma aquisição de imagem multiespectral de cada campo (Figura 2C).
      8. Clique em "Armazenamento de Dados" para armazenar as imagens na pasta selecionada no início em LabID.
         nota: O processo é resumido e ilustrado na Figura 2. Para cada etapa (detecção de tecido, seleção de campo), um algoritmo pode ser incrementado e treinado pelo usuário para um processo de varredura totalmente automatizado.

Tabela 1: Composição do tampão de TBS e TBST. A TBS é usada para misturas e diluições de anticorpos. Para lavagens, todas as etapas são realizadas com TBS, exceto as lavagens após anticorpos primários, onde TBST é recomendado.

	Tbs	TBST
Tris-HCl	0,05 metros	0,05 metros
NaCl	0,15 m	0,15 m
Pré-adolescente 20	-	0,05%
ph	7.6	7.6
preparação	1 comprimido em 500 mL H2O

Tabela 2: Composição detalhada da mistura de anticorpos para coloração de imunofluorescência CD8-PD-1-Tim-3. Para cada mistura de anticorpos primários, secundários e terciários, a diluição a ser realizada no volume correspondente de TBS é dada para um volume total de 1 mL. Para uma lâmina, o volume total da reação é de 100 μL para uma área de tecido de 2 cm².

O volume do anticorpo primário			V final = 1mL
Coelho anti-CD8	Mouse anti-PD-1	Cabra anti-Tim-3	Tbs
1,6 μL	2 μL	30 μL	966,4 μL
O volume do anticorpo secundário
Ciano 5 anti-coelho	Anti-rato biotinilado	Alexa Fluor 488 anti-cabra	Tbs
3,3 μL	2 μL	2,5 μL	992.2
O volume de anticorpo terciário
	Cy3 estreptavidina marcada		Tbs
	3,3 μL		996,7

Resultados

Figura 1: Imunomarcação de CD8-PD-1-Tim-3 em um tecido embebido em parafina de amígdalas. Seções de tecido embebidas em parafina em vez de seções criopreservadas foram selecionadas para imunomarcação tripla. Após a desparafinação e reidratação, foi aplicado o mesmo protocolo de coloração previamente desenvolvido para cortes criopreservados. As células T CD8+ estão localizadas fora do centro germinati...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Vectra 3 Imagem de Patologia Quantitativa Automatizada	Perkin Elmer	CLS142338
Análise de células do inForm 2.1.	Perkin Elmer	CLS135781
Software R	https://www.r-project.org
Caneta delimitadora Dakopen	Dako	S2002
Tris Buffer Solução Salina TBS Comprimidos	Takara, Bio Inc.	TAKT9141Z	pH7.6 100 comprimido
Tris Buffer Salino Tween 20 TBS (+Tween20)	Takara, Bio Inc.	TAKT9142Z	pH 7,6 100 comprimidos
Sistema de bloqueio de biotina	Dako	X0590	Avidina 0,1% e Biotina 0,01%
Soro de burro normal	Jackson Imunopesquisa	017-000-001	Concentração de 5% vol./vol.
Fluoroshield com DAPI	Sigma-aldrich	F6057	Concentração de 1,5 μg/mL
Lamínula de vidro Knittel	Knittel Gläser,	100039	24x60 mm 100 lamínulas
Coelho anti-CD8 Clone P17-V	Novus	NBP1-79055	use a 4μg/mL
NAT de clone anti-PD-1 de camundongo	abcam	AB52587	use a 2 μg/mL
Cabra anti-Tim-3	R&d	AF2365	use a 3 μg/mL
Coelho anti-PD-L1 Clone SP142	Roche	7309457001	use a 1 μg/mL
Mouse AF647 rotulado pan- Clone de queratina C11	Sinalização celular	Nº 4528	use a 0,5 μg/mL
Cabra anti-humana gal9	R&d	AF2045	use a 0,3 μg/mL
Ciano 5 burro conjugado anti-coelho	Jackson Imunopesquisa	711-175-152	use a 5 μg/mL
IgG anti-rato de burro F (ab'2) biotinilada	Jackson Imunopesquisa	Rolamento 715-066-150	use a 3 μg/mL
Alexa Fluor488 burro conjugado anti-cabra IgG	abcam	AB150133	use a 5 μg/mL
Cy3 estreptavidina marcada	Amersham	PA43001	use a 3 μg/mL
Camundongo de controle negativo IgG1	Dako	X0931	use a 2 μg/mL
IgG do soro de cabra	Sigma-aldrich	I5256	use a 3 μg/mL
IgG do soro de coelho	Sigma-aldrich	I5006	use a 4μg/mL