Uma técnica de imunofluorescência para localização de proteínas virais em células infectadas

Resumo

Fonte: Samrat, S. K. et al., Análise temporal da translocação nuclear para citoplasmática de uma proteína 1 do vírus Herpes Simplex por microscopia confocal imunofluorescente.J. Vis. Exp.(2018)

Este vídeo demonstra um método para monitorar a proteína 0 da célula infectada, o tráfego de ICP0 na infecção pelo vírus herpes simplex-1. Após a síntese de novo, a ICP0 se transloca para o núcleo, movendo-se posteriormente para o citoplasma durante a progressão da infecção. A microscopia de imunofluorescência revela e analisa a localização subcelular da proteína, oferecendo informações sobre seu tráfego nas fases de infecção.

Protocolo

1. Semeadura Celular e Infecção por Vírus

1. Às 20 a 24 h antes da infecção pelo vírus, semear 5 x 10⁴ de células de fibroblastos de pulmão embrionário humano (HEL) ou outras células a serem examinadas em uma lâmina escalonada de 4 poços de 11 mm em meio de crescimento (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS)). Incubar as células a 37 °C com 5% de dióxido de carbono (CO₂).
   nota: Cada poço deve ter 70-80% de confluência celular no momento da infecção.
2. No dia seguinte, remova o meio de crescimento e infecte as células com vírus em Medium-199 em uma faixa de 4 a 10 ufc / célula. Incubar células infectadas por vírus durante 1 h a 37 °C. Continuar a agitar a lâmina durante o período de incubação.
3. Após a incubação de 1 h, remover o Medium-199 e suplementar com meio de crescimento.
   nota: Medicamentos que interferem em diferentes fases da infecção podem ser adicionados nesta etapa ou antes da absorção viral.
4. Incubar as células infectadas pelo vírus a 37 °C com 5% de CO₂ durante vários períodos de infecção.

2. Fixação e Permeabilização

1. No momento adequado da infecção, lave rapidamente as células infectadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) 3 vezes e adicione 200 μL de paraformaldeído a 4% recém-preparado em PBS. Incube as células com paraformaldeído por 8 a 10 minutos em temperatura ambiente para fixar as células em cada poço.
2. Aspire o paraformaldeído e lave os poços com 200 μL de PBS por 3 vezes. Aspire completamente o PBS após a^3ª lavagem.
3. Adicione 100 μL de surfactante não iônico a 0,2% em cada poço para permeabilizar as células por 5 a 10 min.
4. Aspirar o tensoactivo não iónico e lavar os alvéolos com 200 μL de PBS durante 3 vezes.

3. Coloração imunofluorescente

1. Aspirar completamente o PBS e adicionar 200 μL de tampão bloqueador (1% de albumina de soro bovino (BSA) e 5% de soro de cavalo em PBS) em cada poço e incubar à temperatura ambiente por 1 h ou a 4 ° C durante a noite.
2. Adicionar a concentração experimentalmente determinada de anticorpo primário contra a proteína 0 da célula infectada (anticorpo policlonal anti-ICP0 de coelho) no tampão de bloqueio e incubar o anticorpo primário à temperatura ambiente durante 2 h ou a 4 °C durante a noite.
3. Lave com tampão de bloqueio 3 vezes com 10 min de incubação. Adicione o anticorpo secundário anti-coelho de cabra conjugado com Alexa 594 (1:400 diluído em tampão de bloqueio) e incube as lâminas em temperatura ambiente por 1 h. Em seguida, lave as lâminas 3 vezes com tampão de bloqueio em intervalos de 10 minutos.
4. Por fim, lave a lâmina uma vez com PBS para remover o BSA residual e o soro de cavalo.
5. Adicione uma gota de meio de montagem antidesbotamento com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para montar a lâmina e selá-la com lamínula usando esmalte transparente.

4. Imagem Confocal

1. Com um microscópio confocal, defina o comprimento de onda em 590–650 nm para Alexa 594 e 410–520 nm para DAPI. Selecione o formato de imagem em 1024 x 1024 e a média da linha de 8 para adquirir imagens de alta resolução.
2. Analise cada poço na lâmina de 4 poços sob um microscópio confocal. Adquira imagens de células representativas sob a objetiva 100X, conforme mostrado na Figura 1 e na Figura 2.
3. Para contar um grande número de células, tire imagens de campos consecutivos sob o objetivo 40X.
   nota: São necessárias de 5 a 10 imagens para acumular mais de 200 células infectadas de cada ponto de tempo de cada infecção.
4. Em cada experimento, tire fotos com parâmetros confocais constantes para todas as amostras que precisam ser comparadas.

5. Analisando a distribuição nuclear vs. citoplasmática

1. Projeto aberto com o software de aplicação confocal. Selecione uma imagem a partir da qual as células precisam ser tabuladas para distribuição nuclear vs. citoplasmática de ICP0.
2. Clique na guia "Quantidade" no menu superior e selecione "classificar ROIs" no menu de ferramentas.
3. Desenhe uma linha longitudinal ao longo da célula a ser analisada selecionando "Desenhar linha" no menu superior.
   nota: O histograma aparecerá mostrando a intensidade de fluorescência ao longo da linha para ICP0 e DAPI. No histograma, a linha azul representa os pixels DAPI e marca o limite do núcleo, enquanto a linha vermelha representa os pixels ICP0.
4. Com base na coloração de fundo, configure um limite constante para a intensidade do ICP0 para analisar a distribuição subcelular do ICP0 em cada experimento.
   1. Conforme exemplificado na Figura 2, se o sinal vermelho estiver em média abaixo do limite na região nuclear, mas estiver acima do limiar além do limite azul, categorize o sinal vermelho como predominantemente localizado no citoplasma.
   2. Se o sinal vermelho estiver acima do limite em todo o núcleo e além do limite do sinal azul, agrupe o sinal vermelho como núcleo mais localização citoplasmática.
   3. Se o sinal vermelho estiver acima do limite no núcleo, mas em média estiver abaixo dele fora do limite do sinal azul, agrupe o sinal vermelho como localização nuclear.
5. Tabule mais de 200 células infectadas de cada amostra em diferentes momentos de infecção e plote em gráfico de barras para ilustrar o movimento do ICP0 de acordo com o tempo (Figura 3).

Resultados

Figura 1: Tráfego dinâmico de ICP0 durante a infecção por HSV-1.As células HEL cultivadas em lâminas de 4 poços foram infectadas com o protótipo HSV-1 (cepa F) a 10 pfu/célula. Em 1, 5 e 9 h após a infecção (hpi), as células foram fixadas, permeabilizadas e reagiram a anticorpos primários anti-ICP0 de coelho e anti-PML de camundongo e, em seguida, reagiram a anticorpos secundários anti-coelho conjuga...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células e vírus
Fibroblastos pulmonares embrionários humanos (células HEL)	Dr. Thomas E. Shenk (Universidade de Princeton)		As células HEL foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FBS
Estoque viral HSV-1 (Cepa F)	Laboratório Dr. Bernard Roizman
Média
Meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)	Invitrogen	11965-092
Soro fetal bovino (FBS)	sigma	F0926-500ml
Médio-199 (10X)	Gibco	11825-015
Reagentes
4- poço 11 mm corrediça escalonada	Cel-Line/Thermofisher Científico	30-149H-PRETO
Solução de paraformaldeído a 16% (p / v) Sem metanol	Thermo Científico	Rolamento 28908
Tritão X-100	Reagentes de Fisher	BP151-1C0
Abumina de soro bovino (BSA)	Calbioquímica	CAS 9048-46-8
Soro de Cavalo	sigma	H1270
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7,4)	Laboratório do Dr. Haidong Gu
NaCl	Biorreagente Fisher	BP358-212
KH2PO4	Biorreagente Fisher	BP362-500
Kcl	Fisher Científico	BP366-500
Na2HPO4	Biorreagente Fisher	BP332-500
Tampão de bloqueio (PBS com 1% de BSA e 5% de soro de cavalo)	Laboratório do Dr. Haidong Gu
Rabiit Anti-ICP0 anticorpo	Laboratório do Dr. Haidong Gu
PML (PG-M3) - IgG monoclonal de camundongo	Santa Cruz Biotecnologia	SC-966
Alexa Fluor 594-cabra anti-coelho IgG	invitrogen	A11012
Alexa Fluor 488-cabra anti-rato IgG	invitrogen	A11001
Meio de montagem Vectashield com DAPI	Laboratórios de vetores	H-1200
Pipeta Pasteur	Marca Fisher	13-678-20D
esmalte	Sally Hansen
equipamento
Microscópio Confocal	Leica SP8
Software Confocal	Suíte de aplicativos Leica LAS X
Software Excel	Microsoft Excel
Incubadora de CO2 HERAcell 150i	Thermo Científico	Código do pedido 51026282