Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Excisão cirúrgica e preparo do tecido
- Eutanasiar o camundongo injetando intraperitonealmente 1 mL de tribromoetanol (preparado de acordo com o protocolo padrão; Tabela de Materiais).
nota: A asfixia por CO2 deve ser evitada em estudos pulmonares, pois pode causar lesão pulmonar e alterar as características e propriedades das células imunes pulmonares. A luxação cervical também deve ser evitada, pois pode causar lesões mecânicas no pulmão.
- Transfira o mouse para uma área limpa e dedicada para operação cirúrgica.
- Estabilize o lado dorsal do camundongo para baixo usando agulhas ou fita adesiva nas quatro extremidades. Use etanol 70% para higienizar a pele da região ventral.
- Faça uma incisão na pele, do pescoço ao abdômen. Remova cuidadosamente a pele da área torácica.
- Remova cuidadosamente o esterno e as costelas.
- Lave os pulmões injetando 10 mL de solução salina tamponada com fosfato frio (PBS) diretamente no ventrículo direito, usando uma agulha 18-21 G, até que os pulmões fiquem completamente brancos.
- Remova cuidadosamente o timo e o coração sem tocar nos pulmões.
- Retire suavemente os pulmões dos tecidos circundantes e transfira-os para um tubo com tampão de albumina de soro bovino (BSA) frio (Tabela 1).
nota: Deve-se fazer um esforço para remover toda a gordura adjacente dos pulmões antes de preparar a suspensão unicelular, pois isso pode influenciar as leituras.
2. Preparação da suspensão unicelular
- Transfira os pulmões para uma placa de Petri vazia e pique-os com dois bisturis finos. Transfira todos os pedaços do pulmão picado para um novo tubo cônico de 50 mL. Use 5 mL de tampão de digestão para lavar a placa e adicione-o ao tubo de 50 mL contendo o pulmão picado (Tabela 1).
nota: O tampão de digestão deve ser preparado imediatamente antes do uso. Use 5 mg / mL de colagenase. A combinação de 1 ou 5 mg de colagenase com tampão BSA ou PBS livre de proteínas não melhorou os resultados (Figura 1).
- Fixe a tampa do tubo e digere o pulmão por 30 min em um agitador orbital a uma velocidade de 150 rpm a 37 °C. Pare a reação adicionando 10 mL de tampão BSA frio.
- Após a digestão, use uma agulha de 18 G para misturar e dissolver os pedaços de pulmão. Coloque um filtro de filtro de 70 μm na parte superior de um novo tubo cônico de 50 mL.
nota: O uso de um filtro de mícron menor pode resultar na perda de grandes populações mielóides.
- Transfira lentamente a mistura pulmonar digerida diretamente no filtro. Use o lado de borracha de um êmbolo de seringa de 10 mL para esmagar os pedaços de pulmão restantes no filtro. Lave o material processado no filtro com tampão BSA.
- Centrifugar a suspensão monocelular a 350 × g durante 8 min a 4 °C.
- Descarte cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK). Misture bem usando uma pipeta de 1 mL e incube por 90 s em temperatura ambiente.
- Adicione 10 mL de tampão BSA frio para interromper a reação e centrifugue a 350 × g por 7 min a 4 ° C. Descarte cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet no tampão de coloração para contar as células usando um hemocitômetro.
- Ressuspenda as células a uma concentração de 5 × 106 células/ml e utilize-as para coloração superficial (ver secção 2).
nota: Para isso, coloque as células em uma placa de fundo redondo de 96 poços, seguida de coloração e lavagem de anticorpos. Se uma centrífuga de placas não estiver disponível, use tubos de fluxo em vez de placas. Com este protocolo, ~ 15-20 × 106 células por pulmão podem ser obtidas de um camundongo C57BL / 6 de 6 semanas de idade de tamanho médio.
3. Coloração de anticorpos de superfície
- Transfira 1 × 106 células em 200 μL por poço em uma placa de 96 poços. Centrifugar a placa a 350 × g durante 7 min a 4 °C. Enquanto isso, prepare a solução do bloco Fc diluindo o anticorpo anti-16/32 (1:100) em tampão de coloração (Tabela 1).
- Ressuspender as células em 50 μL da solução pré-preparada de bloqueio de Fc (Tabela de Materiais) e incubar por 15-20 min a 4 ° C ou no gelo.
- Adicione 150 μL de tampão de coloração e centrifugue a placa a 350 × g por 5 min a 4 °C. Enquanto isso, prepare o coquetel de anticorpos de superfície diluindo os anticorpos de superfície (1:100; Tabela 2) em coloração buffer.
NOTA: (i) O anticorpo anti-16/32 para bloqueio de Fc pode ser usado com os anticorpos de superfície na mesma mistura. (ii) Se for usado corante de viabilidade fixável, adicione-o ao coquetel de anticorpos de superfície em uma diluição de 1:1.000.
- Ressuspenda as células em 50 μL do coquetel de anticorpos de superfície pré-preparado e incube por 30-40 min a 4 ° C no escuro. Lave as células com tampão de coloração duas vezes.
nota: Se não for necessária coloração intracelular, ressuspender as células em 200 μL de tampão de coloração e proceder diretamente à aquisição de dados no citômetro de fluxo. Em alternativa, as células podem ser fixadas e armazenadas a 4 °C para aquisição posterior. Recomendamos o uso das células para citometria de fluxo dentro de 24 h.
4. Fixação celular e coloração intracelular
- Prepare o tampão de fixação/permeabilização (Fix/Perm Buffer) misturando três partes de concentrado de fixação/permeabilização e 1 parte de diluente de fixação/permeabilização do conjunto de tampão de coloração FoxP3/Fator de Transcrição (Tabela 1).
- Ressuspenda as células em 50 μL do tampão Fix/Perm pré-preparado por poço da placa de 96 poços, onde as células foram plaqueadas conforme descrito na seção 3, e incube-as por 20-25 min a 4 ° C no escuro.
- Dilua o tampão de permeabilização 10x como 1: 10 em água deionizada purificada para preparar o tampão de permeabilização 1x.
- Lave as células uma vez com 1x tampão de permeabilização. Enquanto isso, prepare o coquetel de anticorpos intracelulares diluindo os anticorpos intracelulares (1:100) em 1 mL de tampão de permeabilização.
- Ressuspender as células utilizando 50 μL do cocktail de anticorpos de superfície pré-preparado por célula da placa de 96 poços e incubar durante 40 min a 4 °C no escuro.
- Lave as células uma vez com tampão de permeabilização e uma vez com tampão de coloração. Após a lavagem final, ressuspenda as células em 200 μL de tampão de coloração.
nota: Se nenhum citômetro de fluxo com leitor de placas estiver disponível, transfira as células para tubos de citometria de fluxo.
- Adquira um mínimo de 1,5 × 106 células por amostra no citômetro de fluxo.
nota: Para cores únicas e amostras de controle não coradas, 0,5-1 × 106 células por amostra serão suficientes. Recomenda-se titular os anticorpos individuais usados para obter uma coloração ideal e reduzir custos. O presente protocolo foi otimizado usando Fix / Perm Buffer preparado usando o conjunto de buffer de coloração FoxP3. Como o CD68 é um marcador citoplasmático e não nuclear, outras soluções de permeabilização, como uma baixa concentração de paraformaldeído ou kits de citofix/citoperm de vários fornecedores, podem ser suficientes.
Tabela 1: Buffers.
| Tampão BSA | PBS + 0,5% de albumina de soro bovino |
| Tampão de digestão | Tampão BSA pré-aquecido (37 °C) + 5 mg/mL de colagenase tipo 1 + 0,2 mg/mL de DNase I |
| Tampão de coloração | PBS + 2,5% FBS |
| Buffer de correção/perm | Três partes do diluente de fixação/permeabilização e 1 parte do diluente de fixação/permeabilização do conjunto de tampão de coloração Foxp3/Fator de Transcrição |
| Tampão de permeabilização | Tampão de permeabilização 10x do conjunto de tampão de coloração Foxp3/Fator de Transcrição diluído 10 vezes em água deionizada purificada |
Tabela 2: Uso de anticorpos monoclonais.
| antígeno | clone | Fluorochrome | diluição | Superfície/intracelular |
| CD45 | 30-F11 | APC/CY7 | 1:100 | Superfície |
| Gr-1 | RB6-8C5 | BV421 | 1:100 | Superfície |
| CD68 | FA-11 | PerCPCy5.5 | 1:100 | intracelular |
| CD11b | M1/70 | PECy7 | 1:100 | Superfície |
| Siglec F | S17007L | FITC | 1:100 | Superfície |
| CD11c | N418 | BV650 ou BV510 | 1:100 | Superfície |
| CD64 | X54-5/7.1 | PE/Dazzle 594 | 1:100 | Superfície |
| MHC-II | M5/114.15.2 | AF700 | 1:100 | Superfície |
| CD103 | 2.00E+07 | PE / FITC | 1:100 | Superfície |
| Kit de Mancha de Célula Morta de Leitura Distante Corrigível Vivo/Morto | | FarRed (APC) ou Aqua (BV510) | 1:1000 | Superfície |
| CD3 | 17A2 | Pe | 1:100 | Superfície |
| B220 | RA3-6B2 | AF488 | 1:100 | Superfície |
| NK1.1 | PK136 | FITC | 1:100 | Superfície |
| CD24 | 30-F1 | Pe | 1:100 | Superfície |
| MERTK | 2B10C42 | Pe | 1:100 | Superfície |
| F4/80 | BM8 | BV605 | 1:100 | Superfície |
| CX3CR1 | SA011F11 | Pe | 1:100 | Superfície |
| FcBlock (CD16/32) | 93 | | 1:100 | Superfície |
