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1. Preparação de células criptocócicas
- Risque o organismo de teste com um laço de inoculação em uma placa de ágar de levedura-malte-extrato (YM) estéril.
- Incubar a placa de ágar-ágar a 30°C durante 48 h.
- Use um loop de inoculação para colher 5 colônias individuais e suspendê-las em 5 mL de água destilada estéril.
- Padronize as células usando um padrão McFarland para obter uma concentração celular entre 0,5 × 105 e 2,5 × 105 unidades formadoras de colônias (UFC) por mL de meio RPMI-1640.
- Dispense uma suspensão celular de 100 μL em poços de placas de microtitulação que contenham macrófagos semeados (consulte a seção abaixo).
2. Preparação de macrófagos
- Cultive uma linhagem celular de macrófagos murinos, RAW 264.7, em um frasco de tecido contendo 10 mL de meio RPMI-1640, suplementado com 20 mg / mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 20 U / mL de penicilina e 10% de soro fetal bovino.
- Colocar o balão numa incubadora de CO2 a 5% regulada para 37°C até atingir 80% de confluência.
- Raspe suavemente as células usando um raspador de células.
- Transfira as células suspensas para um tubo de centrífuga de 15 mL.
- Use a coloração azul de tripano para determinar a viabilidade celular.
nota: É preferível uma pontuação de viabilidade acima de 85%.
- Use um hemocitômetro para ajustar a concentração celular dos macrófagos para 1 ×10 6 células/mL usando uma solução de 10 mL de meio RPMI-1640 fresco e estéril.
- Dispense 100 μL de suspensão de células em alvéolos de uma placa de microtitulação estéril de 96 poços de fundo plano.
- Incubar a placa durante a noite em uma incubadora de CO5% 2 a 37°C.
nota: Antes do uso, o meio gasto durante a noite deve ser aspirado e substituído por 100 μL de meio fresco e estéril do Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640).
3. Preparação do composto
- Dissolva os fotossensibilizadores de teste e a primaquina (PQ) em água destilada para preparar uma solução de reserva.
- Diluir ainda mais o composto em mídia RPMI-1640.
nota: A quantidade final de água destilada no meio RPMI-1640 nunca deve exceder 1%.
- Dispense uma solução de 100 μL do fotossensibilizador preparado para quadruplicar a concentração desejada em poços apropriados contendo os macrófagos e células criptocócicas já semeados.
4. Implementação do tratamento fotodinâmico (PDT)
- Configure as seguintes condições experimentais:
- Células co-cultivadas com 0 μM de PQ e expostas à luz escura (DL) por 2 min (ou seja, células não tratadas (não Rx))
- Células co-cultivadas com 6 μM e expostas a DL por 2 min (ou seja, efeito da droga)
- Células co-cultivadas 15 μM de PQ e expostas a DL por 2 min (ou seja, efeito da droga)
- Células co-cultivadas com 30 μM de PQ e expostas a DL por 2 min (ou seja, efeito da droga)
- Células co-cultivadas com 0 μM de PQ e expostas ao ultravioleta (UV) por 2 min (efeito UV)
- Células co-cultivadas com 6 μM de PQ e expostas à luz ultravioleta (UVL) por 2 min (ou seja, efeito PDT)
- Células co-cultivadas com 15 μM de PQ e expostas a UVL por 2 min (ou seja, efeito PDT)
- Células co-cultivadas com 30 μM de PQ e expostas a UVL por 2 min (ou seja, efeito PDT)
nota: As células cocultivadas devem reagir com PQ por 30 min no escuro (quando aplicável), antes da exposição à UVL (quando aplicável).
nota: No trabalho atual, determinamos que o PQ tem uma absorção UV/Vis de 260 nm, que está na faixa UV da lâmpada germicida. Devido a este último, usamos uma lâmpada ultravioleta germicida C (UVC) instalada em um gabinete de segurança biológica Classe II como fonte de luz para implementar a PDT. A lâmpada é relatada como tendo uma potência nominal de 30 watts. As células foram mantidas a aproximadamente 20 cm da lâmpada no estudo atual. A essa distância, estima-se que a lâmpada tenha uma saída de radiação de 625 μW/cm2.
5. Contagem de colônias para determinar a sobrevivência de células criptocócicas
- Depois de iniciar o tratamento fotodinâmico das células co-cultivadas conforme indicado acima, incubar as placas a 37 ° C em 5 % de CO2 por 18 h.
- Após 18 h, aspirar o sobrenadante.
- Lave os poços com 200 μL de solução tampão fosfato (PBS) para lavar as células não internalizadas. Repita esta etapa três vezes.
- Adicione 300 μL de Triton X-100 a 0,1% aos poços e incube em temperatura ambiente por 10 minutos.
- Aspire o conteúdo dos poços e distribua-o em tubos plásticos estéreis de 1,5 mL.
- Prepare uma diluição de 1 em 10 das células com água destilada.
nota: Ajustar a diluição de modo a permitir a recuperação entre 30 e 300 colónias em placas de ágar-ágar.
- Pipetar 50 μL da diluição para uma placa de ágar-ágar malte de levedura (YM).
- Use um método de placa espalhada para criar um gramado de confluência de células na superfície da placa de ágar.
- Incubar as placas a 30°°C durante 48 h.
- Contar as unidades formadoras de colónias (UFC) desenvolvidas nas placas de ágar.