O efeito da aspirina e do ibuprofeno na capacidade fagocítica dos macrófagos

Resumo

Este vídeo mostra um método para avaliar o impacto da aspirina e do ibuprofeno, em suas concentrações inibitórias mínimas, na fagocitose de macrófagos usando células fúngicas coradas com corante fluorescente sensível ao pH. As drogas inibem a ciclooxigenase-2, diminuindo a formação de prostaglandinas e aumentando a fagocitose de macrófagos, conforme observado por meio de medições de fluorescência de corantes sensíveis ao pH.

Protocolo

1. Considerações de segurança

1. O pessoal deve usar equipamento de proteção individual (EPI).
2. Manuseie o patógeno e os macrófagos em um gabinete de segurança biológica Classe II.

2. Preparação de macrófagos

1. Cultive uma linhagem celular de macrófagos murinos, RAW 264.7, em um frasco de tecido contendo 10 mL de meio Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640), suplementado com 20 mg / mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 20 U / mL de penicilina e 10% de soro fetal bovino (FBS).
2. Colocar o balão numa incubadora de dióxido de carbono (CO₂) a 5% regulada para 37°C até atingir 80% de confluência.
3. Raspe suavemente as células usando um raspador de células.
4. Transfira as células suspensas para um tubo de centrífuga de 15 mL.
5. Use a coloração azul de tripano para determinar a viabilidade celular.
   nota: É preferível um escore de viabilidade acima de 85%.
   Use um hemocitômetro para ajustar a concentração celular de macrófagos para 1 ×^{10 5} células / mL usando uma solução de 10 mL de meio RPMI-1640 fresco e estéril. Dispense 100 μL de suspensão de células em poços de uma placa de microtitulação estéril de fundo plano de 96 poços. Incubar a placa durante a noite em uma incubadora de CO_{5% 2} a 37°C.
   nota: O meio gasto durante a noite deve ser aspirado e substituído por 100 μL de meio RPMI-1640 novo e estéril antes do uso.

3. Preparação de células criptocócicas

1. Risque o organismo de teste com um laço de inoculação em uma placa de ágar de levedura-malte-extrato (YM) estéril.
2. Incubar a placa de ágar-ágar a 30°C durante 48 h.
3. Usando uma alça de inoculação, inocule uma alça cheia de células em 100 mL de caldo de base de nitrogênio de levedura (YNB) suplementado com 4% de glicose.
4. Cultive as células (pré-cultura) durante a noite enquanto agita a 160 rpm a 30 ° C.
5. No dia seguinte, inocular 0,1 mL da pré-cultura em caldo fresco de YNB (cultura principal) e permitir que as células cresçam até a fase exponencial média (sob as mesmas condições de cultivo).
6. Lave as células duas vezes com solução tampão fosfato (PBS).
7. Usando um hemocitômetro, padronize as células para 1 x 10⁵ em PBS.

4. Coloração de células criptocócicas com a coloração de fagocitose

1. Dispense 999 μL das células em um tubo de plástico de 1,5 mL.
2. Adicione 1 μL da coloração verde pHrodo zymosan A ao mesmo tubo.
3. Incubar as células à temperatura ambiente durante 1 h, no escuro, com agitação lenta para reagir com a mancha.
4. No final do período de incubação, lave as células três vezes com PBS.
5. Dispensar uma suspensão celular de 100 μL a alvéolos contendo macrófagos semeados.

5. Preparação de medicamentos

1. Prepare uma solução de aspirina usando 1 mg de aspirina em 1000 mL de etanol absoluto até uma concentração final de 1000 μg / mL.
2. Dilua ainda mais o composto em meio RPMI-1640 para atingir as concentrações desejadas do medicamento.
   nota: A quantidade final de etanol no meio RPMI-1640 nunca deve exceder 1%. Prepare uma solução estoque de ibuprofeno usando 1 mg de ibuprofeno em 1000 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Dilua ainda mais o composto em meio RPMI-1640 para atingir as concentrações desejadas do medicamento.
   nota: A quantidade final de DMSO em mídia RPMI-1640 nunca deve exceder 1%. Prepare uma solução de 100 μL dos medicamentos preparados em concentrações quádruplas e distribua em poços apropriados contendo macrófagos semeados e células criptocócicas.

6. O efeito dos agentes quimio-sensibilizantes na fagocitose de macrófagos

1. Incube as placas com células co-cultivadas na presença de agentes quimiossensibilizantes, aspirina ou ibuprofeno em uma incubadora de CO₂ a 5% a 37 ° C por 2 h ou 6 h.
2. Ao final do período de incubação, medir a fluorescência induzida (ex: 492 nm e em: 538 nm).
   nota: A coloração de pHrodo só fluoresce em ambientes ácidos, como dentro do fagossomo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ágar	Merck		Usado para preparar placas YM
Extrato de levedura	Merck		Usado para preparar placas YM
Extrato de malte	Merck		Usado para preparar placas YM
Peptona	Merck		Usado para preparar placas YM
Base de nitrogênio de levedura (YNB)	Laboratórios Difco		Usado no cultivo de células criptocócicas
glicose	Merck		Usado para preparar placas YM
Mancha azul de tripano	Sigma-Aldrich		Para enumerar células vivas e mortas
Tampão fosfato	Sigma-Aldrich		Lave e dilua as células
RPMI- 1640 médio	Biocromo		Meios de cultivo para macrófagos
Soro fetal bovino (FBS)	Biocromo		Usado para complementar o meio RPMI-1640
Penicilina/estreptomicina/L-glutamina	Sigma-Aldrich		Adicionado ao meio RPMI-1640
pHrodo verde zymosan A mancha	Tecnologias da Vida		Usado para corar células internalizadas devido a uma mudança no pH
Ácido acetilsalicílico (aspirina)	Sigma-Aldrich		A droga que deve ser testada
Etanol absoluto	Merk		Usado para dissolver a aspirina
ibuprofeno	Sigma-Aldrich		Medicamento a ser testado
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Merk		Usado para dissolver o ibuprofeno
Placas de microtitulação de fundo plano de 96 poços	Greiner Bio-One		Usado como um recipiente dentro do qual as reações foram realizadas
Balão de tecido	Lasec		Usado para cultivar macrófagos
Tubo de centrífuga de 15 mL	Lasec		Usado para conter macrófagos
Raspador de células	Lasec		Usado para separar macrófagos do frasco de tecido
Circuito de inoculação	Lasec		Usado para listrar a cultura na placa de ágar
Hemocitômetro	Marienfield		Para determinar a concentração celular dos macrófagos
Tubos de plástico de 1,5 mL	Merck		Usado como um recipiente dentro do qual as reações foram realizadas
Espectrofotômetro de pesquisa EZ Read 800	Biocromo		Para ler a densidade óptica
Fluoroskan Ascent FL	Termo-Científico		Para medir a fluorescência
Incubadora de CO2	Thermo-Fisher		Usado para incubar os macrófagos
Cabine de segurança biológica classe II	ESCO		Para trabalhar com segurança com os patógenos sem causar danos ao usuário.