Um método de imunofluorescência para medir a neutralização do citomegalovírus humano

Resumo

Este vídeo demonstra um ensaio de imunofluorescência projetado para medir a neutralização do citomegalovírus humano (HCMV). Anticorpos específicos do vírus são misturados com o vírus e incubados com células de fibroblastos humanos. Os anticorpos neutralizam o vírus, tornando-o incapaz de infectar as células hospedeiras, enquanto os vírus não neutralizados infectam as células. Após a incubação, a extensão da neutralização é determinada quantificando as células infectadas pelo vírus usando imunofluorescência.

Protocolo

1. Preparação das células-alvo para a infecção

1. Semeie as células-alvo no dia anterior à realização do experimento em uma placa de 96 poços (a placa 'alvo').
2. Plaquear células suficientes por poço para garantir uma monocamada quase confluente (~90%).
   nota: Isso dependerá do tamanho relativo do seu tipo de célula de destino. Se estiver usando fibroblastos de prepúcio humano (HFFs), semeie 20.000 células/poço.
3. Normalmente, 21 poços (7 abaixo por 3 de largura) devem ser semeados por amostra, permitindo que 4 amostras sejam analisadas por placa.
4. Semeie 12 poços adicionais por placa (ou seja, linha 8) para servir como controles.

2. Preparação do vírus: misturas de anticorpos

1. Adicione 90 μL de meio combinado com anticorpo (e bem misturado) para criar o dobro da concentração inicial desejada de anticorpos de teste em 3 poços da linha 1 de uma placa nova de 96 poços (a placa de 'diluição').
   nota: Uma concentração inicial típica de anticorpos seria de 20 μg/mL, mas deve ser determinada empiricamente.
2. Adicione 60 μL de meio a cada um dos 18 poços abaixo (ou seja, 6 abaixo de 3 de diâmetro) os 3 poços da etapa 2.1.
3. Adicione 60 μL de meio a 12 poços adicionais (ou seja, linha 8).
4. Transferir 30 μL de diluição de anticorpos da linha 1 para os alvéolos correspondentes na linha 2.
5. Misture o conteúdo da linha 2 pipetando suavemente para cima e para baixo 20 vezes com a pipeta multicanal.
6. Transferir 30 μL de diluição de anticorpos da linha 2 para a linha 3.
7. Repetir este processo de mistura e transferência até que o conteúdo da linha 7 tenha sido misturado.
8. Uma vez que a linha 7 tenha sido misturada, descarte 30 μL dos poços na linha 7.
9. Diluir o HCMV em um meio completo para que 50 μL contenham partículas infecciosas suficientes para resultar em uma infecção por MOI=1 se adicionados diretamente às células.
   nota: O HCMV é um patógeno da categoria Biossegurança Nível 2 (BSL-2). Certifique-se de que os procedimentos de segurança adequados estejam em vigor e use pontas de filtro para todos os meios expostos ao HCMV.
   nota: Isso requer o mesmo número de partículas infecciosas que existem células/poço, o que varia de acordo com o tipo de célula e o tropismo do vírus. Se estiver usando HFFs conforme descrito acima, a concentração de vírus necessária é 4x10⁵ pfu/mL.
   nota: Certifique-se de que um excesso suficiente de vírus diluído (por exemplo, 10% extra) seja preparado.
10. Adicione 60 μL de estoque de vírus diluído a todos os poços contendo diluições de anticorpos e 6 poços que contenham apenas 60 μL de meio.
11. Adicione apenas 60 μL de meio aos 6 poços restantes de meio, para servir como controles não infectados.
12. Incubar o vírus resultante: misturas de anticorpos a 37^oC por 1 h.

3. Infecção de células-alvo

1. Remova todas as mídias das células de destino.
2. Utilizando uma pipeta multicanal, transferir 100 μL de mistura de vírus: anticorpos da placa de «diluição» para as células na posição equivalente na placa «alvo».
3. Incubar as células a 37 °C, 5% de CO₂ por 24 h.

4. Fixação de células

1. Remova todas as mídias de cells.
   nota: Não há necessidade de trocar as pontas entre os poços neste momento.
2. Lave todos os poços com 200 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e remova.
3. Adicione 180 μL -20 ^oC, 100% de etanol a todos os poços.
4. Incubar a placa a -20 ^oC por pelo menos 30 min.
   nota: Essa etapa pode ser estendida para pelo menos um mês, desde que seja adicionado etanol adicional à medida que começa a evaporar.
   nota: A placa é segura para manusear sob as condições BSL-1 a partir deste ponto, e podem ser usadas pontas sem filtro.

5. Detecção de células infectadas por vírus por imunofluorescência (IF)

1. Remova o etanol da placa.
2. Lave todos os poços com 200 μL de PBS e remova.
3. Adicione 200 μL de PBS a todos os poços e incube por 5 min.
   1. Enquanto isso, prepare a diluição primária do anticorpo em PBS.
   2. Serão necessários 100 μL de anti-IE monoclonal de camundongo 1:2000 por poço (observe que a diluição é para o anticorpo específico listado nos materiais).
      NOTA: A diluição do anticorpo usado para IF pode precisar ser otimizada se uma alternativa for usada.
   3. Mistura de vórtice para garantir uma mistura suficiente.
4. Remova o PBS de todos os poços e adicione 100 μL de diluição de anticorpos primários.
5. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
6. Remova o anticorpo primário de todos os poços.
7. Adicione 200 μL de PBS e incube por 5 min.
   1. Enquanto isso, prepare o anticorpo secundário e a diluição de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em PBS.
   2. Serão necessários 100 μL de IgG anti-camundongo conjugado com fluoróforo 1:2000 e 1 μg/mL de DAPI por poço.
   3. NOTA: A diluição do anticorpo secundário usado para IF pode precisar ser otimizada se uma alternativa for usada.
   4. Mistura de vórtice para garantir uma mistura suficiente.
8. Remova o PBS de todos os poços e adicione 100 μL de diluição de anticorpos secundários/DAPI.
9. Incubar a placa à temperatura ambiente durante 1 h, protegida da luz.
10. Remova o anticorpo secundário / DAPI de todos os poços.
11. Lave todos os poços com 200 μL de PBS e remova.
12. Adicione 200 μL de PBS a todos os poços e incube por 5 min.
13. Remova o PBS e adicione 100 μL de PBS a todos os poços e armazene, protegido da luz, a 4 ^oC até que esteja pronto para a imagem.
    nota: As placas podem ser armazenadas por até um mês com perda mínima de qualidade de sinal/imagem.

6. Imagem e contagem de células infectadas

1. Para quantificar a infecção com facilidade e precisão, obtenha imagens de pelo menos 25% de cada poço, nos canais azul (DAPI, núcleos) e de anticorpos secundários (proteínas precoces (IE) do HCMV).
   nota: O sinal gerado pela imunofluorescência EI deve ser semelhante ao da coloração nuclear e as imagens devem ser verificadas para confirmar isso.
2. Isso pode ser feito manualmente, mas recomenda-se o uso de um microscópio automatizado.
   nota: A ampliação dependerá do seu instrumento, mas como grandes estruturas (núcleos) estão sendo visualizadas, objetivas 4X/10X são normalmente suficientes.
3. Depois que as imagens forem adquiridas, processe-as por meio do programa de análise de software de sua escolha.
   1. Primeiro, identifique os núcleos através do canal azul, para calcular o número de células presentes.
   2. Apenas essas áreas precisam ser verificadas quanto ao sinal no canal vermelho, já que a EI é uma proteína localizada no núcleo, para calcular o número de células infectadas.
4. Uma vez calculado o número de células infectadas e o número total de células, calcule a porcentagem de infecção por poço.
5. Esses valores podem ser corrigidos para os níveis de detecção de fundo, subtraindo-se a porcentagem média de infecção observada em poços não infectados de todos os outros poços.
   nota: Isso deve ser bem abaixo de 1%. Se for superior a 1%, o procedimento de análise requer otimização.
6. Esses valores corrigidos em segundo plano agora podem ser plotados, interrogados e analisados conforme desejado.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Clone monoclonal 6F8.2 do anticorpo do anti-IE do rato	Millipore	MAB8131	Anticorpo primário para imunofluorescência
Coelho Anti-Mouse IgG, Alexa fluor 568 anticorpo conjugado	Invitrogen	A-11061	Anticorpo secundário para imunofluorescência
Sistema de imagem de alto conteúdo WiScan® Hermes	Ideia Biomédica	-	Microscópio fluorescente automatizado de alto rendimento para quantificação
Software de análise de imagem metamorfo	Dispositivos Moleculares	-	Software de análise de imagens
Controle de isotipo IgG1 humano	Merck	M5284	Anticorpo de controle para neutralização
8F9, anticorpo anti-glicoproteína B anti-HCMV	-	-	Anticorpo neutralizante para HCMV
DAPI	Thermo Científico	Nº 62248	Coloração de núcleos celulares
DMI4000B microscópio de fluorescência invertida	Leica	-	Microscópio fluorescente usado para imagens representativas