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1. Acoplamento covalente de anticorpos de captura a microesferas MagPlex
Cada anticorpo de captura é conjugado a um conjunto específico de microesferas magnéticas carboxiladas usando um procedimento de duas etapas, conforme descrito abaixo.
NOTA: Um kit de acoplamento incluindo todos os reagentes, tampões e materiais necessários para o acoplamento de microesferas também está disponível (consulte TABELA DE MATERIAIS).
- Ressuspenda a suspensão de microesferas desacoplada de acordo com as instruções descritas na folha de informações do produto fornecida com suas microesferas.
nota: As instruções de ressuspensão dependerão do tamanho e volume de seus frascos de microesferas de estoque.
- Transfira 2.5 x 106 das microesferas de estoque para um tubo de microcentrífuga recomendado (consulte TABELA DE MATERIAIS).
- Coloque o tubo em um separador magnético e deixe a separação ocorrer por 60 segundos.
- Com o tubo ainda posicionado no separador magnético, remova o sobrenadante.
nota: Tome cuidado para não perturbar as microesferas.
- Retirar o tubo do separador magnético e ressuspender as microesferas a 100 μL de dH2O por vórtice e sonicação durante 20 segundos.
- Repita as etapas 3 e 4.
- Retirar o tubo do separador magnético e ressuspender as microesferas lavadas 80 μL de fosfato de sódio monobásico 0,1 M, pH 6,2 por vórtice e sonicação durante 20 segundos.
- Adicione 10 μL de N-hidroxisulfosuccinimida 50 mg / mL (sulfo-NHS) (diluído em fosfato de sódio monobásico 0,1 M, pH 6,2) às microesferas e misture suavemente por um vórtice.
- Adicionar 10 μL de cloridrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) a 50 mg/ml (diluído em fosfato de sódio monobásico 0,1 M, pH 6,2) às microesferas e misturar suavemente por um vórtice.
- Incube por 20 minutos em temperatura ambiente com mistura suave por vórtice em intervalos de 10 minutos.
- Coloque o tubo em um separador magnético e deixe a separação ocorrer por 60 segundos.
- Com o tubo ainda posicionado no separador magnético, remova o sobrenadante.
nota: Tome cuidado para não perturbar as microesferas.
- Retirar o tubo do separador magnético e ressuspender as microesferas em 250 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4 por vórtice e sonicação durante cerca de 20 segundos.
- Coloque o tubo em um separador magnético e deixe a separação ocorrer por 60 segundos.
- Com o tubo ainda posicionado no separador magnético, remova o sobrenadante.
nota: Tome cuidado para não perturbar as microesferas.
- Repita as etapas 13 a 15 para um total de duas lavagens.
- Remova o tubo do separador magnético e ressuspenda as microesferas ativadas e lavadas em 100 μL de PBS, pH 7,4 por vórtice e sonicação por aproximadamente 20 segundos.
- Adicione 12,5 μg de anticorpo de captura às microesferas ressuspensas (ou seja, 5 μg/1 milhão de microesferas).
nota: Os anticorpos monoclonais são preferidos para captura, mas os anticorpos policlonais também podem ser usados.
NOTA: 5 μg de proteína por 1 milhão de grânulos normalmente têm um bom desempenho, mas recomendamos titular a quantidade para obter o desempenho ideal do ensaio.
- Traga o volume total para 500 μL com PBS, pH 7,4.
- Misturar a reação de acoplamento por um vórtice.
- Incubar durante 2 horas com mistura por rotação à temperatura ambiente no escuro.
- Coloque o tubo em um separador magnético e deixe a separação ocorrer por 60 segundos.
- Com o tubo ainda posicionado no separador magnético, remova o sobrenadante.
nota: Tome cuidado para não perturbar as microesferas.
- Retirar o tubo do separador magnético e ressuspender as microesferas acopladas em 1 ml de PBS, pH 7,4 contendo 0,02% de Tween-20, 0,1% de albumina de soro bovino (BSA), 0,05% de azida sódica (PBS-TBN) por vórtice e sonicação durante 20 segundos.
- Coloque o tubo em um separador magnético e deixe a separação ocorrer por 60 segundos.
- Com o tubo ainda posicionado no separador magnético, remova o sobrenadante.
nota: Tome cuidado para não perturbar as microesferas.
- Repita as etapas 24-26 para um total de duas lavagens.
- Retirar o tubo do separador magnético e ressuspender as microesferas acopladas em 500 μL de PBS-TBN.
nota: Determine o número de microesferas recuperadas usando um contador de células ou hemocitômetro.
- Armazene as microesferas acopladas refrigeradas a 2-8°C no escuro.
nota: Um protocolo para confirmar a eficiência do acoplamento também está disponível.
2. Marcação de anticorpos de detecção de biotina
- Os anticorpos de detecção foram marcados com biotina usando hexanoato de sulfosuccinimidil-6-(biotinamido) EZ-Link de acordo com as instruções do fabricante com um excesso molar de 20 vezes de reagente de biotina para atingir 4-6 grupos de biotina por molécula de anticorpo.
nota: Os anticorpos policlonais são normalmente usados para detecção, mas os anticorpos monoclonais também podem ser usados se forem específicos para um epítopo diferente do anticorpo de captura.
nota: Em alternativa, podem ser utilizados anticorpos biotinilados disponíveis no mercado para a deteção.
3. Detecção de Organismos por Imunoensaio Sanduíche de Captura Multiplexada
Os conjuntos de microesferas acoplados e os anticorpos de detecção marcados gerados em 1 e 2 acima são usados em um imunoensaio sanduíche de captura multiplexada para detectar e quantificar as bactérias presentes em uma amostra. Uma visão geral do fluxo de trabalho do ensaio é mostrada na Figura 1.
- Selecione os frascos de estoque de conjuntos de esferas MagPlex acoplados a anticorpos de armazenamento de 2 a 8ºC.
- Vórtice e sonicate por 20 segundos.
- Prepare uma mistura de grânulos multiplexados de trabalho de modo que cada conjunto de grânulos esteja em uma concentração final de 2500 microesferas por 50 μL para cada poço de reação (50.000 grânulos / conjunto / ml) em PBS-TBN.
nota: Use uma planilha para determinar os parâmetros de preparação para a mistura de esferas de trabalho.
nota: Esferas de controle interno (microesferas de monitor RP1) também podem ser incluídas para monitorar o desempenho do ensaio e do instrumento.
- Pipetar 50 μL de mistura de esferas de trabalho nos poços apropriados de uma placa de 96 poços.
- Pipetar 50 μL de padrão ou amostra para os poços apropriados.
- Pipetar 50 μL de PBS-TBN para cada poço de fundo.
- Cubra a placa com um selo de alumínio para proteger as contas da luz e incube em um agitador de placas em temperatura ambiente por 1 hora com agitação a 800 rpm.
- Coloque a placa em um separador magnético de placas por 1 minuto.
- Mantendo a placa no separador magnético de placas, remova cuidadosamente a folha e inverta a placa para esvaziar os poços, depois bata para secar em uma espessa camada de toalhas de papel de laboratório 3-4 vezes.
nota: Como alternativa, aspire manualmente os poços usando um pipetador multicanal ou use uma lavadora de placas automatizada.
- Use um pipetador multicanal para adicionar 200 μL de PBS-TBN a cada poço e agite por 1 minuto em um agitador de placas a 800 rpm.
- Coloque a placa em um separador magnético de placas por 1 minuto.
- Mantendo a placa no separador de placas magnéticas, inverta a placa para esvaziar os poços e, em seguida, bata para secar em uma espessa camada de toalhas de papel de laboratório 3-4 vezes.
nota: Como alternativa, aspire manualmente os poços usando um pipetador multicanal ou use uma lavadora de placas automatizada.
- Repita as etapas 10 a 12 para um total de duas lavagens.
nota: Remova o máximo de tampão possível antes de prosseguir para a próxima etapa para evitar uma possível diluição da reação.
- Use um pipetador multicanal para adicionar 50 μL de tampão de ensaio a cada poço e agite por 1 minuto em um agitador de placas a 800 rpm.
- Diluir o anticorpo de detecção biotinilado para 4 μg/ml em PBS-TBN.
- Adicione 50 μL do anticorpo de detecção diluído a cada poço.
- Cubra a placa com um selo de alumínio para proteger as contas da luz e incube em um agitador de placas em temperatura ambiente por 1 hora com agitação a 800 rpm.
- Coloque a placa em um separador magnético de placas por 1 minuto.
- Mantendo a placa no separador de placas magnéticas, inverta a placa para esvaziar os poços e, em seguida, bata para secar em uma espessa camada de toalhas de papel de laboratório 3-4 vezes.
nota: Como alternativa, aspire manualmente os poços usando um pipetador multicanal ou use uma lavadora de placas automatizada.
- Lave cada poço duas vezes seguindo o procedimento descrito nas etapas 10-12.
nota: Remova o máximo de tampão possível antes de prosseguir para a próxima etapa para evitar uma possível diluição da reação.
- Use um pipetador multicanal para adicionar 50 μL de tampão de ensaio a cada poço e agite por 1 minuto em um agitador de placas a 800 rpm. Estreptavidina, Conjugado R-Ficoeritrina (SAPE).
- Diluir o relator SAPE para 4 μg/ml em tampão de ensaio.
- Adicionar 50 μL do SAPE diluído a cada alvéolo.
- Cubra a placa com um selo de alumínio para proteger as esferas e o SAPE da luz e incube em um agitador de placas em temperatura ambiente por 30 minutos com agitação a 800 rpm.
- Coloque a placa em um separador magnético de placas por 1 minuto.
- Mantendo a placa no separador de placas magnéticas, inverta a placa para esvaziar os poços e, em seguida, bata para secar em uma espessa camada de toalhas de papel de laboratório 3-4 vezes.
NOTA: Como alternativa, aspire manualmente os poços usando um pipetador multicanal ou use uma lavadora de placas automatizada.
- Lave cada poço duas vezes seguindo o procedimento descrito nas etapas 10-12.
- Adicione 100 μL de PBS-TBN a cada poço e agite por 1 minuto em um agitador de placas a 800 rpm.
- Analise 50 μL de cada reação no analisador Luminex (de acordo com o Manual do Usuário do analisador utilizado), coletando um mínimo de 50 esferas por conjunto de esferas para análise. Uma breve descrição do xMAP INTELLIFLEX® é fornecida abaixo.
- Selecione o menu suspenso no canto superior esquerdo da tela e navegue até Configuração da placa.
- Selecione Executar placa.
- Selecione o ícone Ejetar para ejetar o suporte da placa.
- Carregue a placa no suporte da placa e selecione o ícone Retrair para retrair o suporte da placa.
- Selecione o ícone Executar para executar a placa.
