Isolamento e digestão de proteínas neutrófilas

Resumo

Este vídeo demonstra o isolamento da proteína dos neutrófilos, que é posteriormente processado e digerido em peptídeos menores. Esses peptídeos podem ser usados para análises futuras.

Protocolo

1. Coleta e lise de células neutrófilas

1. Colete células HL60 diferenciadas por neutrófilos em um tubo de 15 mL centrifugando amostras a 400 x g por 5 minutos.
   nota: Os neutrófilos devem estar em uma confluência de 3,5 x 10⁵ células/mL após a diferenciação. Colha aproximadamente cinco milhões de células para extração total do proteoma.
2. Descarte o sobrenadante e adicione 15 mL de solução tamponada com fosfato (PBS) no tubo.
3. Centrifugue amostras a 400 x g por 5 min.
4. Repita as etapas 1.2 a 1.3.
   nota: As amostras de células podem ser congeladas rapidamente com nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ° C após a Etapa 1.4, dependendo do período de tempo experimental.
5. Adicionar 300 μl de cloridrato de Tris (hidroximetil)aminometano (Tris-HCl) frio a 100 mM pH 8,5 contendo um comprimido de cocktail inibidor da proteinase (PIC) a cada amostra.
6. Amostras de vórtice brevemente.
7. Adicione 1/10 do volume de 20% de SDS a uma concentração final de 2% de SDS.
8. Para lisar amostras de células, sonde as amostras em um banho de gelo por 30s ligado e 30s desligado por cinco ciclos a 10% da potência.
9. Centrifugue as amostras em uma rotação curta (velocidade máxima por 5-10 seg).
   nota: Não deixe os detritos celulares se espalharem. Use um giro curto para coletar o spray das paredes do tubo.
10. Transfira amostras do tubo de 15 mL para um tubo de 2 mL.
11. Adicionar 1/10 de volume de 1 M de Ditiotreitol (DTT) a uma concentração final de 10 mM de DTT.
12. Amostras de vórtice brevemente.
13. Incubar amostras por 10 min com agitação a 800 rpm a 95°C.
14. Após 10 min, resfrie as amostras à temperatura ambiente.
    nota: As amostras podem ser colocadas no gelo para acelerar o processo de resfriamento.
15. Adicionar 1/10 do volume de 0,55 mM de iodoacetamida (IAA) a uma concentração final de 55 mM de IAA.
    nota: Execute a Etapa 1.15 no escuro para evitar expor o IAA à luz.
16. Amostras de vórtice brevemente.
17. Incube as amostras em temperatura ambiente por 20 min no escuro.
18. Adicione 100% de acetona gelada a uma concentração final de 80% e armazene as amostras a -20 °C durante a noite.
    nota: O armazenamento a -20 °C pode ser feito por até duas semanas, se necessário.

2. Digestão de proteínas neutrófilas

1. Centrifugue amostras a 13.500 rpm a 4°C por 10 min para precipitar os pellets celulares.
2. Descarte o sobrenadante e lave os pellets celulares com 500 μl de acetona gelada a 80%.
3. Centrifugue amostras a 13.500 rpm a 4 ° C por 10 min e remova o sobrenadante.
4. Repita as etapas 2.1 a 2.3.
5. Pellets secos ao ar.
6. Depois de seco, adicione 100 μl de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanossulfônico (HEPES) 8 M de ureia/40 mM ao pellet celular e sonicado em banho-maria a 4 °C por 30s ligado e desligado, por 15 ciclos para resolubilizar os pellets de proteína.
7. O uso do ensaio de triptofano de albumina de soro bovino (BSA) (ou equivalente) quantifica a concentração de proteína de acordo com as instruções do fabricante.
8. Adicionar 300 μl de bicarbonato de amónio (ABC) para diluir a amostra até uma concentração final de 2 M de ureia.
9. Para digerir 50 μg de proteína, adicione tripsina / LysC 1:50 (proporção enzima/proteína) às amostras no gelo - misture as amostras batendo suavemente.
10. Incube as amostras à temperatura ambiente durante a noite para realizar a digestão.

Resultados

Figura 1. Fluxo de trabalho de células HL60 diferenciadas em neutrófilos para perfil proteômico baseado em espectrometria de massa. Linhagens celulares HL60 indiferenciadas e diferenciadas (via estimulação química DMSO) foram cultivadas, coletadas e processadas para extração total do proteoma. As proteínas foram digeridas com tripsina / LysC e os peptídeos foram purificados usando C18 STAGE-tips, seg...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo Falcon de 15 ml	VWR	Rolamento 470225-000
25 mL sorológico	Fisher Científico	14955235
Bicarbonato de amônio (ABC)	ThermoFisher Scientific	Rolamento A643-500
acetona	Sigma Aldrich	34850-1L
Kit de ensaio BSA	VWR	CA62408-940
Centrífuga 5810 R	Sigma Aldrich	EP022628188
Ditiotreitol (TDT)	ThermoFisher Scientific	R0861	Prepare 1M de estoque de alíquotas TDT e armazene a -20°C
Soro fetal bovino (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	Descongele, prepare alíquotas e armazene a -20°C
Bloco de aquecimento
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Prepare alíquotas de ureia 8M / HEPES 40m, armazene a -20 ° C
Iodoacetamida (IAA)	Fisher Científico	AAA1471514	Prepare um estoque de 0,55 milhão de alíquotas de IAA e armazene a -20 ° C. Evite a exposição à luz
L-glutamina	Fisher Científico	25030081	Descongele, prepare alíquotas e armazene a -20°C
Nitrogênio líquido
Tubos de microcentrífuga LoBind	Eppendorf	Telefone: 13-698-794
Penicilina estreptomicina, anfotericina	Sigma Aldrich	Rolamento A5955	Descongele, prepare alíquotas e armazene a -20°C
Células HL60 diferenciadas por neutrófilos
Solução tamponada com fosfato (PBS)	Bioshop	PBS408	Armazene em temperatura ambiente
Sonicador de sonda	Fisher Científico	100-132-894
Comprimido de coquetel inibidor de protease (PIC)	Sigma Aldrich	5892791001	Armazenar a 4°C
RPMI 1640	ThermoFisher Scientific	11875093	Armazenar a 4°C
Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)	ThermoFisher Scientific	J18220. A1	preparar solução SDS a 2%
Centrífuga SpeedVac	Eppendorf	07-748-15
Frascos T75	ThermoFisher Scientific	156499
Tris HCL pH 8,5	Fisher Científico	BP152-1	Armazenar a 4°C
Banho ultrassônico	VWR	Rolamento 97043-960
ureia	Bioshop	URE001.1