Um procedimento de ponta STAGE para dessalinização e purificação de peptídeos

Resumo

Este vídeo demonstra a purificação de peptídeos por meio do procedimento STAGE Tip. Uma coluna em miniatura contendo grânulos de resina ligados a longas cadeias de hidrocarbonetos facilita a purificação baseada em interação hidrofóbica. Ao carregar uma amostra de peptídeo pré-digerida na coluna, os fragmentos de peptídeo se ligam aos grânulos de resina, permitindo a passagem de impurezas. Um tampão de eluição que interrompe a interação hidrofóbica é aplicado para eluir os fragmentos de peptídeos.

Protocolo

1. Purificação e dessalinização de peptídeos

1. Embale três camadas de resina C18 em uma ponteira de pipeta de 200 μl para cada amostra de peptídeo para construir uma ponteira de extração STop And Go (STAGE).
2. Adicione 1/10 de solução de parada (20% de acetonitrila [ACN)] e 6% de ácido trifluoroacético [TFA]) às amostras.
3. Centrifugue amostras para precipitação de pellets a 13.200 rpm por 10 min.
4. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 2 ml e elimine o sedimento.
5. Lave as pontas do estágio com 100 μl de 100% ACN.
6. Centrifugue as pontas STAGE a 1000 x g por 2 min.
   nota: Centrifugue as pontas do STAGE até que todo o líquido tenha passado pela resina C18.
7. Lave as pontas STAGE com 50 μl de tampão B (80% ACN, 0,5% de ácido acético e ddH₂O).
8. Centrifugue as pontas STAGE a 1000 x g por 2 min.
9. Lave as pontas STAGE com 200 μl de tampão A (2% ACN, 0,1% TFA, 0,5% de ácido acético e ddH₂O).
10. Centrifugue as pontas do estágio a 1000 x g por 2 min.
11. Carregue amostras em pontas STAGE.
12. Centrifugue amostras a 1000 x g por 3-5 min.
13. Lave as pontas STAGE com 200 μl de tampão A.
14. Centrifugue a 1000 x g por 3-5 min.
15. Adicione 50 μl de tampão B em cada ponta STAGE
16. Usando uma seringa, elua amostras contendo tampão B em um tubo de tira de PCR de 0,2 mL.
17. Depois que as amostras forem eluídas, seque os peptídeos usando uma centrífuga a vácuo por 45 minutos.
18. Depois que as amostras estiverem secas, armazene-as em temperatura ambiente até MS.
    nota: Se o armazenamento de peptídeos for necessário por mais de duas semanas, sugerimos armazenar a -20 ° C.
19. Execute a amostra em uma espectrometria de massa (MS) de alta resolução).
    nota: Os parâmetros de medição da amostra (por exemplo, quantidade de amostra carregada, comprimento do gradiente de cromatografia líquida, resolução) dependerão da instrumentação usada.

2. Perfil proteômico de neutrófilos

1. Processamento de dados brutos
   1. Carregue arquivos de dados brutos obtidos do MS no MaxQuant.
   2. O software foi projetado para ser executado com arquivos de aquisição dependentes de dados de baixo para cima, e muitos parâmetros padrão são otimizados para essas amostras. Os parâmetros padrão incluem digestão (tripsina P), modificações variáveis da oxidação da metionina (oxidação (M)) e N-acetilação de proteínas (acetil (proteína N-term)) e modificações fixas da carbamidometilação da cisteína (carbamidometil (C)).
   3. Os ajustes nesses parâmetros incluem quantificação sem rótulo (LFQ; defina a contagem mínima de proporção como 1), correspondência entre execuções (ou seja, ligado/desligado) e um número mínimo de peptídeos identificados por proteína (recomenda-se definir como 2).
   4. Nos parâmetros globais, importe o arquivo FASTA para identificação da sequência. Para este experimento, foi utilizado o arquivo FASTA do Homo sapiens (Humano) (UP000005640) do banco de dados Uniprot. nota: Registre as seguintes informações para manutenção de registros: ID do organismo = 9606; o número de proteínas = 79.740; data de download do arquivo.
   5. Defina o número de núcleos de computador a serem usados para processamento e selecione Iniciar.
   6. Após a conclusão do MaxQuant, uma pasta 'combinada', juntamente com outros arquivos, será gerada.
      nota: Os outros arquivos podem ser usados para identificar peptídeos, modificações, etc., e podem ser necessários para carregar o conjunto de dados completo em repositórios de dados, incluindo Proteome Xchange (PRIDE).
2. Análise e visualização de dados no Perseus
   1. Carregue o 'proteingroups.txt' no Perseus e selecione todos os arquivos de intensidade LFQ para a janela 'Principal'.
      nota: As informações de linha de base são importadas diretamente para as janelas do Perseus, mas outras informações (por exemplo, locais de modificação) podem precisar ser adicionadas manualmente.
   2. Filtre as linhas removendo contaminantes, peptídeos reversos e peptídeos identificados apenas pelo local.
   3. Transforme os dados pelo log₂(x).
   4. Para observar o número de proteínas detectadas em cada replicação, construa um diagrama numérico de Venn.
   5. Defina anotações categoriais para cada amostra.
      nota: Para fins estatísticos, todos os replicados de uma amostra biológica devem ter o mesmo nome.
   6. Filtrar linhas com base em valores válidos, com a proteína identificada em >50% das repetições e dentro de pelo menos um grupo.
      nota: A filtragem por valores válidos pode ser mais rigorosa, dependendo da configuração e dos objetivos do experimento (por exemplo, a proteína deve estar presente em todas as amostras).
   7. Para substituir os valores ausentes para LFQ, a imputação da distribuição normal pode ser realizada.
      NOTA: os parâmetros padrão são otimizados para dados LFQ, mas podem ser ajustados conforme desejado.
   8. Adicione informações de anotação às linhas de proteína. Adicione o arquivo FASTA txt.gz (obtido no site da Perseus) nas pastas 'bin', 'conf' e 'annotation' e traga termos específicos (por exemplo, nomes de proteínas, nomes de genes, ontologia genética).
   9. A matriz agora está completa e pode ser usada para testes estatísticos (por exemplo, ANOVA, testes t) para determinar mudanças significativas na abundância de proteínas entre as condições testadas. Outras formas de ferramentas de visualização incluem gráficos de análise de componentes principais, mapas de calor e enriquecimento de categorias.
      nota: As informações de anotação também podem ser baixadas do UniProt e integradas à estrutura Perseus.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo Falcon de 15 ml	VWR	Rolamento 470225-000
25 mL sorológico	Fisher Científico	14955235
Bicarbonato de amônio (ABC)	ThermoFisher Scientific	Rolamento A643-500
ácido acético	Sigma Aldrich	1099510001
acetona	Sigma Aldrich	34850-1L
Acetonitrila (ACN), grau MS	furar	TS-51101
Kit de ensaio BSA	VWR	CA62408-940
Discos C18 (dicas STAGE)	Fisher Científico	13110019
Centrífuga 5810 R	Sigma Aldrich	EP022628188
Ditiotreitol (TDT)	ThermoFisher Scientific	R0861	Prepare 1M de estoque de alíquotas TDT e armazene a -20°C
Soro fetal bovino (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	Descongele, prepare alíquotas e armazene a -20°C
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Prepare alíquotas de ureia 8M / HEPES 40m, armazene a -20 ° C
Espectrômetro de massa de alta resolução	ThermoFisher Scientific	726042
Iodoacetamida (IAA)	Fisher Científico	AAA1471514	Prepare um estoque de 0,55 milhão de alíquotas de IAA e armazene a -20 ° C. Evite a exposição à luz
L-glutamina	Fisher Científico	25030081	Descongele, prepare alíquotas e armazene a -20°C
Tubos de microcentrífuga LoBind	Eppendorf	Telefone: 13-698-794
MaxQuant	https://www.maxquant.org/
Tubos de tiras de PCR	VWR	Rolamento 76318-802
Penicilina estreptomicina, anfotericina	Sigma Aldrich	Rolamento A5955	Descongele, prepare alíquotas e armazene a -20°C
Perseu	https://www.maxquant.org/Perseus/
solução tamponada com fosfato (PBS)	Bioshop	PBS408	Armazene em temperatura ambiente
Sonicador de sonda	Fisher Científico	100-132-894
Comprimido de coquetel inibidor de protease (PIC)	Sigma Aldrich	5892791001	Armazenar a 4°C
RPMI 1640	ThermoFisher Scientific	11875093	Armazenar a 4°C
Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)	ThermoFisher Scientific	J18220. A1	preparar solução SDS a 2%
Centrífuga SpeedVac	Eppendorf	07-748-15
Centrífuga basculante STAGE	Sonação	STC-V2
Frascos T75	ThermoFisher Scientific	156499
Ácido trifluoroacético	ThermoFisher Scientific	Rolamento 85183
Tris HCL pH 8,5	Fisher Científico	BP152-1	Armazenar a 4°C
Tripsina / LysC	Thermo Fisher Científico	Rolamento A40009	alíquota e armazenar a -20 °C
Banho ultrassônico	VWR	Rolamento 97043-960
ureia	Bioshop	URE001.1