$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Ensaio de neutralização baseado em pseudotipo
NOTA: pMN é a inibição da transdução mediada por vírus de pseudotipo (PV) por meio de amostras de soro convalescente humano que contêm anticorpos direcionados contra o SARS-CoV-2 Spike.
- Em uma placa branca de 96 poços com o auxílio de uma pipeta multicanal, adicione 50 μl de meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM), 10% de soro bovino fetaval (FBS), 1% de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep) às linhas B a H, colunas 1-12.
- Adicione 5 μl de soros convalescentes nos poços da linha A, colunas 2-10, em um volume total de 100 μl de DMEM/10% FBS/1% P/S. Adicione uma quantidade conhecida (por exemplo, 5 μl) de anti-soros positivos (calibrante NIBSC 20/162, pool 2 ou pool 3 de HICC) e negativos (soros de pacientes coletados antes de 2019) nos poços A11 e A12 como controles.
- Remover 50 μl dos alvéolos da fileira A e realizar diluições seriadas duplas em todos os alvéolos abaixo dele.
- Em cada etapa de diluição, utilizar uma pipeta multicanal para misturar 5 a 10 vezes, pipetando para cima e para baixo e tomando cuidado para não produzir bolhas de ar.
- Depois de completar a diluição em série, os 50 μl finais do poço final de cada coluna devem ser descartados.
NOTA: Neste ponto, cada alvéolo deve conter 50 μl de DMEM misto e diluições seriadas de soros de pacientes ou de controle.
- Centrifugue a placa por 1 min a 500 rpm para garantir que nenhum líquido seja deixado nas paredes do poço.
- Usando dados obtidos por titulação de pseudotipo, calcule a quantidade de DMEM necessária para diluir seu PV SARS-CoV-2 para obter 5 x 106 RLU em 50 μl, com um volume total de 5 ml.
- Misturar esta solução fotovoltaica diluída numa bacia de pipeta utilizando a pipeta multicanal e alíquota de 50 μl em cada alvéolo da placa, excepto para os alvéolos A6-A12 (controlo apenas por célula). A1-A6 servirá como controle somente fotovoltaico.
- Centrifugue a placa por 1 min a 500 rpm para garantir que nenhum vírus seja deixado nas paredes do poço.
- Incube as placas por 1 h a 37 °C 5% de dióxido de carbono (CO2), dando tempo para o soro se ligar à glicoproteína SARS-CoV-2.
- Prepare uma placa de células-alvo HEK 293T / 17 transfectadas 24 h antes com plasmídeo de expressão da enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) e plasmídeos de plasmídeo de expressão de serina protease transmembrana 2 (TMPRSS2).
- Remova o meio de cultura da placa.
- Lave a placa duas vezes com 2 ml de PBS em um lado do prato para evitar o descolamento das células e descarte.
- Adicione 2 ml de tripsina à placa e coloque a placa na incubadora até que as células se desprendam.
- Após o desprendimento das células, adicione 6 ml de DMEM/10% FBS/1% de penicilina/estreptomicina à placa para extinguir a atividade da tripsina e ressuspender as células suavemente.
- Conte as células usando o contador de células automatizado TC20TM ou a lâmina da câmara de contagem e adicione 1 x 104 células em um volume total de 50 μl a cada poço.
- Incubar a placa durante 48-72 h, a 37 °C, 5% CO2.
- Leia a placa usando o sistema de ensaio de luciferase Bright GloTM em um luminômetro de microplaca GloMax® Navigator removendo o meio de cultura de todos os poços e adicionando 25 μl de uma mistura 1:1 de PBS: reagente de ensaio de luciferase Bright GloTM.
- A partir dos dados brutos fornecidos pelo luminômetro, calcule a metade dos títulos de anticorpos neutralizantes da concentração inibitória máxima (IC50) usando protocolos estabelecidos. Valores de IC50 abaixo da diluição de 1:40 são considerados negativos. Os dados podem, alternativamente, ser avaliados usando AutoPlate.