Avaliação de anticorpos neutralizantes funcionais contra SARS-CoV-2

Resumo

Este vídeo mostra um ensaio de neutralização que mede a eficácia do soro na neutralização do vírus SARS-CoV-2. Envolve vírus pseudotipados, diluição do soro e quantificação baseada em luminescência, revelando o título de neutralização.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Ensaio de neutralização baseado em pseudotipo

NOTA: pMN é a inibição da transdução mediada por vírus de pseudotipo (PV) por meio de amostras de soro convalescente humano que contêm anticorpos direcionados contra o SARS-CoV-2 Spike.

1. Em uma placa branca de 96 poços com o auxílio de uma pipeta multicanal, adicione 50 μl de meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM), 10% de soro bovino fetaval (FBS), 1% de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep) às linhas B a H, colunas 1-12.
2. Adicione 5 μl de soros convalescentes nos poços da linha A, colunas 2-10, em um volume total de 100 μl de DMEM/10% FBS/1% P/S. Adicione uma quantidade conhecida (por exemplo, 5 μl) de anti-soros positivos (calibrante NIBSC 20/162, pool 2 ou pool 3 de HICC) e negativos (soros de pacientes coletados antes de 2019) nos poços A11 e A12 como controles.
3. Remover 50 μl dos alvéolos da fileira A e realizar diluições seriadas duplas em todos os alvéolos abaixo dele.
4. Em cada etapa de diluição, utilizar uma pipeta multicanal para misturar 5 a 10 vezes, pipetando para cima e para baixo e tomando cuidado para não produzir bolhas de ar.
5. Depois de completar a diluição em série, os 50 μl finais do poço final de cada coluna devem ser descartados.
   NOTA: Neste ponto, cada alvéolo deve conter 50 μl de DMEM misto e diluições seriadas de soros de pacientes ou de controle.
6. Centrifugue a placa por 1 min a 500 rpm para garantir que nenhum líquido seja deixado nas paredes do poço.
7. Usando dados obtidos por titulação de pseudotipo, calcule a quantidade de DMEM necessária para diluir seu PV SARS-CoV-2 para obter 5 x 10⁶ RLU em 50 μl, com um volume total de 5 ml.
8. Misturar esta solução fotovoltaica diluída numa bacia de pipeta utilizando a pipeta multicanal e alíquota de 50 μl em cada alvéolo da placa, excepto para os alvéolos A6-A12 (controlo apenas por célula). A1-A6 servirá como controle somente fotovoltaico.
9. Centrifugue a placa por 1 min a 500 rpm para garantir que nenhum vírus seja deixado nas paredes do poço.
10. Incube as placas por 1 h a 37 °C 5% de dióxido de carbono (CO₂), dando tempo para o soro se ligar à glicoproteína SARS-CoV-2.
11. Prepare uma placa de células-alvo HEK 293T / 17 transfectadas 24 h antes com plasmídeo de expressão da enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) e plasmídeos de plasmídeo de expressão de serina protease transmembrana 2 (TMPRSS2).
    1. Remova o meio de cultura da placa.
    2. Lave a placa duas vezes com 2 ml de PBS em um lado do prato para evitar o descolamento das células e descarte.
    3. Adicione 2 ml de tripsina à placa e coloque a placa na incubadora até que as células se desprendam.
    4. Após o desprendimento das células, adicione 6 ml de DMEM/10% FBS/1% de penicilina/estreptomicina à placa para extinguir a atividade da tripsina e ressuspender as células suavemente.
    5. Conte as células usando o contador de células automatizado TC20^TM ou a lâmina da câmara de contagem e adicione 1 x 10⁴ células em um volume total de 50 μl a cada poço.
12. Incubar a placa durante 48-72 h, a 37 °C, 5% CO₂.
13. Leia a placa usando o sistema de ensaio de luciferase Bright Glo^TM em um luminômetro de microplaca GloMax® Navigator removendo o meio de cultura de todos os poços e adicionando 25 μl de uma mistura 1:1 de PBS: reagente de ensaio de luciferase Bright Glo^TM.
14. A partir dos dados brutos fornecidos pelo luminômetro, calcule a metade dos títulos de anticorpos neutralizantes da concentração inibitória máxima (IC50) usando protocolos estabelecidos. Valores de IC50 abaixo da diluição de 1:40 são considerados negativos. Os dados podem, alternativamente, ser avaliados usando AutoPlate.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ponteiras de pipeta MultiGuard Barrier 1-20 μl	Sorenson BioCiência	30550T
Ponteiras de pipeta MultiGuard Barrier 1-200 μl	Sorenson BioCiência	30550T
Placa de cultura de células NuncTM Delta tratada com superfície (placas estéreis de 10 cm)	Thermo Fisher Científico	Rolamento 150350
Cubas de pipeta (50 ml)	genérico
Placa branca de 96 poços	Thermo FisherScientific	136101
Células HEK 293T/17	ATCC	CRL-11268
Plasmídeo de expressão da enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) do receptor de entrada da célula hospedeira: pCDNA3.1+-ACE2			Simmons 2004
Plasmídeo de expressão da serina protease transmembrana (TMPRSS2) do priming da proteína Spike (S) do coronavírus: pCAGGS-TMPRSS2			Bertram 2010
Meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com 4,5 g/L de glicose, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina (P/S)	Pan-Biotecnologia	P04-04510 P40-37500 Pág. 06-07100
Reagente de transfecção FuGENE® HD, 1ml	Promega	E2311
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol	Pan-Biotecnologia	Pág. 10-040100
Anticorpo de controle positivo (Reagente de Pesquisa para Anti-SARS-CoV-2 Ab) que pode neutralizar o PV SARS-CoV-2 (NIBSC, código: 20/162, disponível internacionalmente ou HICC-pool 2/HICC pool 3)
Plasma convalescente humano COVID-19 para testar
Sistema de ensaio de luciferase Bright Glo	Promega	E2650