Ensaios para avaliação qualitativa e quantitativa das concentrações de glicose na urina de camundongos

Resumo

Este vídeo demonstra um procedimento para coletar urina de camundongo e avaliar seus níveis de glicose. Para avaliar o nível de glicose, mergulhe uma tira de teste revestida com enzimas e um corante cromogênico na amostra, iniciando uma mudança de cor que indica os níveis de glicose. Para quantificar os níveis de glicose na urina, introduza uma amostra de urina em uma placa multipoços com concentrações crescentes de glicose, adicione a mistura de reação e incuba. Meça a absorbância para criar uma curva padrão e calcule os níveis de glicose com base na absorbância da amostra.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Teste de glicose na urina

1. Coloque um pedaço de Parafilm limpo em uma superfície plana.
2. Pegue suavemente um rato pela cauda e coloque-o no Parafilm.
3. Contenha o mouse pela nuca usando o polegar e o indicador. Pegue suavemente o mouse enquanto está preso na nuca, fazendo com que o mouse urine como resposta ao estresse. Deixe cair uma gota de urina na superfície do parafilme. Retorne o mouse à sua gaiola depois de coletar a gota de urina.
4. Mergulhe a extremidade reagente de uma tira de Diastix na gota de urina fresca coletada na superfície do Parafilme. Remova a tira imediatamente e coloque-a plana sobre uma superfície com o lado da cor voltado para cima. Aguarde pelo menos 30 segundos para que uma cor se desenvolva totalmente na tira. Compare a cor revelada com a tabela de referência fornecida no recipiente Diastix (Figura 1).
   Dicas: Se o rato não urinar no Parafilm, aplique uma leve pressão na parte inferior do abdómen do rato (à volta da bexiga urinária) utilizando o dedo indicador. Essa abordagem ajudará a liberar gotas de urina no parafilme. Para camundongos que não urinam após seguir o procedimento descrito acima, aguarde 20 minutos e inicie o procedimento novamente. Certifique-se de que todos os procedimentos sejam realizados de acordo com as diretrizes da IACUC.

2. Coleta de urina de 24 h usando uma gaiola metabólica de camundongo

1. Monte uma gaiola metabólica Tecniplast (Figura 2) de acordo com as instruções do fabricante.
2. Encha o conjunto de alimentação com ração em pó e, em seguida, prenda o conjunto de alimentação na aba de metal apropriada na câmara superior.
3. Fixe o suporte da garrafa de água na aba de metal restante na câmara superior.
4. Encha a garrafa de água vazia e deslize-a para dentro do suporte da garrafa, certificando-se de que o tubo do bebedor esteja no orifício.
5. Coloque um rato na gaiola metabólica e cubra-o com uma tampa.
6. Certifique-se de que a tampa da gaiola esteja encaixada corretamente.
7. Posicione um tubo de coleta de urina e um tubo de coleta de fezes em seus locais apropriados no piso inferior da câmara.
8. Após 24 h, recupere o tubo de coleta de urina e realize um ensaio de glicose para determinar a concentração de glicose na urina. Se o ensaio de glicose não for realizado no mesmo dia, congele a amostra de urina no freezer a -80°C.

3. Determinação da concentração de glicose na urina de 24 h

1. Se a amostra de urina for armazenada a -80°C, deixe a amostra descongelar antes de realizar um ensaio de glicose.
2. A partir do estoque de 100mg/dl, prepare oito padrões que variam de 25mg/dl a 0mg/dl de acordo com as instruções do kit de ensaio.
3. Prepare poços padrão e poços de amostra de urina em uma placa de 96 poços, todos em duplicatas, de acordo com o manual do kit.
4. Depois de iniciar a reação adicionando a quantidade recomendada de mistura enzimática a todos os poços, cubra a placa e deixe-a incubar por 10 min a 37 ° C.
5. Leia a absorbância a 500-520 nm usando um leitor de placas.
6. Analise os dados de acordo com as instruções do kit de ensaio. Plote a absorbância de cada padrão versus a concentração de glicose e use o gráfico para determinar a concentração de glicose da amostra de urina de 24 horas.

Resultados

Figura 1. Teste de glicose na urina no local. As gotas de urina de camundongo coletadas no Parafilm e a tabela de referência de cores fornecida no recipiente Diastix.

Figura 2. Gaiola metabólica Tecniplast para coleta de urina de camundongo por...