Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação da proteína do antígeno MRSA HI
- Obter clones do fator B determinante da superfície do íon Fe (IsdB) e do mutante α-hemolisina (Hla) de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais), realizar amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar os genes IsdB e Hla e ligar seus produtos ao plasmídeo PGEX-6P-2 (obtido comercialmente; ver Tabela de Materiais). Tela com o vetor Xl/cepa azul de Escherichia coli.
- Transforme o clone positivo em células competentes para E. coli BL21 (ver Tabela de Materiais) e amplifique com cultura de tubarão.
- Expressar o antigénio e isolar após indução com kits de isolados de isopropil-β-D-1-mercaptogalactopiranosídeo e cromatografia multimodal (MMC) (ver Tabela de Materiais).
- Caracterize a proteína do antígeno e purifique-a com um purificador de automação total.
- Proteínas marcadas com gutationa S-transferase (GST) de purificação de afinidade de lisados limpos usando uma resina de cromatografia de afinidade disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais).
- Purificar as proteínas recombinantes por isopropil-β-D-1-mercaptogalactopiranosídeo e cromatografia multimodal (MMC).
- Remova a endotoxina pelo método de separação de fases Triton X-114. Resumidamente, misture 1% de Triton X-114 com eluato de proteína recombinante a 0 ° C por 5 min para garantir uma solução homogênea e incube a 37 ° C por 5 min para permitir a formação de duas fases.
- Use o método de teste de endotoxina bacteriana com kits Turtle (consulte a Tabela de Materiais) para detectar a concentração de endotoxina. A endotoxina para antígeno proteico é de 0,06 UE/μg, inferior ao padrão internacional (1,5 UE/μg).
- Realize um teste de interferência para eliminar a possível influência do produto em teste na detecção de endotoxinas.
nota: De acordo com o Apêndice 2020 da farmacopeia chinesa, o teor de endotoxina deve ser inferior a 5 UE/dose. A sensibilidade do lisado de Limulus (λ0,25 UE/mL) e a razão de diluição efetiva máxima de 33,3 foram calculadas com base na diluição máxima válida, MVD = cL/λ, em que L é o valor-limite de endotoxina bacteriana para o artigo de ensaio, c é a concentração da solução do artigo de ensaio e quando L é expresso em UE/m, c é igual a 1,0 mg/mL. λ é a sensibilidade marcada (EU/mL) do reagente do caranguejo-ferradura no método do gel.
- Recombinar o antígeno (48 kDa, determinado por eletroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio a 12% [SDS-PAGE]) a 1,5 mg/mL em água estéril sem endotoxina ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) (método de diclorato de sódio).
NOTA: O tempo de pico da proteína foi de 13,843 min, a pureza foi de 99,4% (método de cromatografia líquida de alta eficiência) e a proteína foi armazenada a -70 °C. O DNA genômico extraído da cepa de S. aureus MRSA252 (ver Tabela de Materiais) foi usado como modelo de PCR. O gene IsdB foi amplificado usando o primer direto 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
C-39 e o primer reverso 59-TTTTCCTTTTGCGG
CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-39.
O gene Hla foi amplificado usando o primer direto PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) e o primer reverso PHLAR (TAAGCGGCCGCTTATCAATTTGTCATTTCTTC).
2. Preparação da vacina contra nanoemulsões
- De acordo com a proporção de massa de 1:6:3 (p/p), adicione três tipos de excipientes em sequência (miristato de isopropil, óleo de rícino de polioxietileno e propilenoglicol; ver Tabela de Materiais) à solução de proteína de antígeno HI (10 mg/mL) e mexa bem. Em seguida, adicione água pura gradualmente esterilizada até atingir um volume final de 10 mL e agite a 500 rpm e 25 °C por aproximadamente 20 min.
nota: A nanoemulsão preparada neste protocolo tem um volume de 10 mL, e as massas dos três excipientes são de 0,34 g, 2 g e 1 g, respectivamente. A solução de proteína aqui é a solução de trabalho, 10 vezes a concentração da solução final.
- Preparar a vacina adjuvante em nanoemulsão (1 mg/mL de proteína) por métodos de emulsificação de baixa energia para obter uma solução líquida límpida e transparente.
nota: A nanoemulsão em branco (BNE) foi preparada por métodos semelhantes, exceto que a água foi substituída por HI. O método de emulsificação usual envolve aquecer as fases externa e interna a aproximadamente 80 °C para emulsificação e, em seguida, agitá-las e resfriá-las gradualmente. Nesse processo, uma grande quantidade de energia é consumida e, finalmente, a emulsão é obtida.
3. Caracterização física e estabilidade da vacina adjuvante em nanoemulsão
- Tamanho de partícula, potencial zeta e caracterização do índice de dispersão do polímero (PDI).
- Prepare 100 μL da vacina adjuvante de nanoemulsão e dilua 50 vezes com água para injeção. Adicione 2 mL de amostra para detecção.
- Observe os tamanhos das partículas, potencial zeta e PDI a 25 ° C usando um Nano Zetasizer (ZS; consulte a Tabela de Materiais).
- Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
- Dilua 10 μL de vacina de nanoemulsão 50 vezes com água, coloque em uma grade de cobre de 100 malhas revestida de carbono e core com ácido fosfotúngstico a 1% (consulte a Tabela de Materiais) por 5 min em temperatura ambiente.
- Remova o excesso de solução de ácido fosfotúngstico com papel de filtro.
- Observe a morfologia em um microscópio eletrônico de transmissão (ver Tabela de Materiais). Examine se os produtos acabados são quase estáveis e circulares dentro do campo de visão do microscópio eletrônico e se eles exibem boa dispersão.
- Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
- Diluir 50 μL da vacina adjuvante de nanoemulsão com água, colocar 10 μL de amostras pré-diluídas em uma pastilha de silício e colocá-las em uma incubadora controlada por termostato a 37 °C por 24 h.
- Pulverize a platina preparada no silício por 40 s e deixe esfriar até a temperatura ambiente.
- Observe as propriedades morfológicas das amostras preparadas em um microscópio eletrônico de varredura de alta resolução (ver Tabela de Materiais). Determine se as amostras são quase estáveis, esféricas e bem dispersas dentro do campo de visão sob o microscópio eletrônico.
- Estabilidade morfológica
- Coloque 1 mL de amostras de vacina de nanoemulsão em tubos de microcentrífuga e avalie a estabilidade das amostras frescas centrifugando por 30 min a 13.000 x g à temperatura ambiente (25 ° C).
- Observar o aspecto destas amostras frescas e, em seguida, efectuar um ensaio de estabilidade termodinâmica de seis ciclos de temperatura (um ciclo: armazenar a 4 °C durante 48 h, 25 °C durante 48 h e 37 °C durante 48 h).
- Após a centrifugação, deixe as amostras repousarem por 15 min para determinar se há um efeito Tyndall (se a amostra é clara e transparente sob a luz) e se ocorreu desemulsificação (mostrada por estratificação clara após desemulsificação).
- SDS-PAGE e western blot
- Agitar as amostras, misturar uma solução de 0,6 mL de etanol absoluto e 0,3 mL de vacina e centrifugar (13.000 x g, 30 min à temperatura ambiente, 25 °C).
- Transferir o sobrenadante da solução para um tubo limpo e dissolver o precipitado com 0,3 ml de água. Obter as soluções sobrenadante e precipitada (nanoemulsão em branco e vacina) após tratamento com etanol absoluto e solução de água destilada e realizar a mesma diluição de 50 vezes.
- Misture 2,5 mL de gel de separação A e 2,5 mL de gel de separação B (consulte a Tabela de Materiais), adicione 50 μL de persulfato de amônio a 10% e coloque rapidamente a solução na placa de vidro com uma pipeta. Misture 1 mL de gel concentrado A e 1 mL de gel concentrado B, adicione 20 μL de persulfato de amônio a 10% na placa de vidro, insira um pente de tamanho apropriado e aguarde a solidificação.
- Adicione um total de 5 μL de solução tampão de carga de proteína 5x à amostra diluída obtida na etapa 3.5.2 e ferva a amostra por 5 min.
- Adicione 10 μL de proteína aquecida ao poço correspondente e adicione 5 μL de marcador de proteína ao poço marcador.
- Conecte o eletrodo, ligue o medidor de eletroforese (consulte a Tabela de Materiais) e ajuste a tensão para 300 V. Desligue a energia quando a eletroforese atingir 1 cm de distância da parte inferior da borracha PAGE.
- Retire o gel e enxágue com água bidestilada (ddH2O). Adicione a solução de coloração azul brilhante G-250 de Coomassie (consulte a Tabela de Materiais) por 10 min. Despeje a solução de coloração e enxágue o gel duas vezes com a solução e a solução de descoloração disponível comercialmente e leve o gel ao micro-ondas por 1 min. Agite o gel por 10 min e troque repetidamente a solução de descoloração até que o fundo do gel esteja claro. Em seguida, realize imagens de gel (consulte a Tabela de Materiais).
nota: O western blot foi pré-processado, conforme descrito nas etapas 3.5.1-3.5.6.
- Mergulhe três blocos de papel de filtro com um tampão de transferência de eletroforese. Mergulhe a membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) em metanol por 30 s e transfira com um instrumento de transferência de gel semi-seco (duas camadas de papel de filtro, membrana de PVDF, gel de eletroforese e uma camada de papel de filtro). Use uma tensão de 23 V para transferir a membrana por 23 min.
- Remova a membrana de PVDF e lave uma vez com solução salina tamponada com tris
- Coloque a membrana de PVDF em solução de vedação (solução de leite em pó desnatado a 5%) e sele durante a noite a 4 °C.
- Remova a membrana de PVDF e lave três vezes com TBST ou 10 min cada.
- Incubar com o anticorpo primário (de camundongos imunizados com soro positivo). Diluir o anticorpo primário (ver Tabela de Materiais) a ser testado 500 vezes (100 vezes) com TBST. Colocar a membrana de PVDF bloqueada no anticorpo primário e incubar a 37 °C durante 1 h.
- Remova a membrana de PVDF e lave três vezes com TBST por 10 min cada.
- Incubar com o anticorpo secundário (ver Tabela de Materiais). Dilua o anticorpo secundário anti-camundongo de cabra marcado com fosfatase alcalina (AP) 5.000 vezes com TBST. Colocar a membrana de PVDF no anticorpo secundário e incubar a 37 °C durante 40 min.
- Remova a membrana de PVDF e lave quatro vezes com TBST por 10 min cada.
- Mergulhe as membranas de PVDF em uma mistura (apenas o suficiente para embeber a membrana) do substrato AP nitro blue tetrazole (NBT) e BCIP (sal de p-toluidina 5-bromo-4-cloro-3'-indolilifosfato) (consulte a Tabela de Materiais) para coloração. Um resultado positivo é purple.
NOTA: Os resultados devem ser uma faixa roxa clara e a tira de amostra e o peso molecular do antígeno devem estar na mesma posição rotulada.
4. Avaliação da resposta imune de anticorpos a esta vacina após administração intramuscular
NOTA: Os camundongos foram imunizados por injeção intramuscular da vacina de nanoemulsão após um relatório publicado. Os camundongos receberam PBS como controle negativo. À 1 semana após a conclusão de três imunizações, o soro foi coletado dos camundongos. Os níveis séricos de IgG e as subclasses de IgG1, IgG2a e IgG2b foram determinados quantitativamente por ensaio imunoenzimático (ELISA).
- Revestimento de antígeno: Dilua o antígeno da proteína HI a 10 μg/mL com solução de revestimento e adicione à placa ELISA a 100 μL/poço. Incubar a 4 °C durante a noite.
nota: A solução de revestimento é preparada dissolvendo 1,6 g de carbonato de sódio anidro e 2,9 g de bicarbonato de sódio em 1 L de água deionizada.
- Selagem: Lave a placa (três ciclos, cada ciclo 300 μL). Adicione 300 μL da solução de vedação a cada poço e sele os poços por 2 h a 37 °C.
nota: A solução de vedação é preparada pela adição de Tween-20 e albumina de soro bovino (BSA) ao PBS. O conteúdo de BSA na solução PBST é de 1%.
- Diluição do soro: Diluir a amostra de soro de camundongos 100 vezes com PBST (pegue 3 μL de soro e adicione a 297 μL de PBST e vórtice) e use 100 μL para cada amostra de soro. Diluir o soro positivo e o soro de controle negativo 100 vezes com PBST adicionando 4 μL a 396 μL de PBST e, em seguida, misturando por vórtice.
- Diluição de proporção dupla: Adicionar 200 μl do soro experimental diluído acima à primeira fileira da placa ELISA revestida e adicionar 100 μl de PBST a todos os alvéolos, exceto a primeira e a12ª fileiras. Efectuar uma diluição de 1:2 sucessivamente a partir da primeira fila: ajustar a pipeta a 100 μl, transferir 100 μL da primeira fila para a segunda fila e misturar com a pipeta 10 vezes.
- Diluir o soro para a linha 11 em proporções múltiplas e descartar 100 μL de líquido.
- Adicionar soro negativo e positivo diluído aos alvéolos correspondentes na linha 12, de acordo com o modelo de amostra (ver quadro 1) -100 μL/alvéolo.
- Selar as placas ELISA com filme plástico e incubar a 37 °C durante 1 h.
- Diluir o anticorpo secundário anti-camundongo IgG-HRP (ver Tabela de Materiais) com PBST a 1:10.000.
- Lave a placa (três ciclos, cada ciclo 300 μL). Em seguida, adicione 100 μL do anticorpo secundário diluído a cada poço e incube a placa a 37 ° C por 40 min.
- Coloração e terminação: Lave a placa (cinco ciclos, cada ciclo 300 μL). Adicionar solução de coloração de 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) (100 μL; ver Tabela de Materiais) a cada alvéolo. Colocar as placas a 37 °C durante 10 min de distância da luz e, em seguida, terminar imediatamente a reacção com 50 μL de 2 M H2SO4.
- Detecte o valor da densidade óptica (OD450) por um marcador enzimático (leia o valor OD450 dentro de 15 minutos após a terminação).
Tabela 1: Sequência de pico ELISA e modelo de diluição.
