1. Avaliação da clivagem ou degradação de proteínas no vírus Influenza A, células infectadas por IAV por caspases
- Semeie 3 x 105 células Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) ou A549 por poço em uma placa de cultura de células de 12 poços.
nota: Se estiver usando células MDCK, certifique-se de que o anticorpo contra a proteína de interesse reconheça sua espécie canina.
- Semeie os poços em pares, ou seja, um par de controle - um poço para a amostra simulada não infectada e um para a amostra simulada infectada, um par de teste - um poço para a amostra A do inibidor não infectado e um para a amostra do inibidor infectado A. Aumente o número de pares com cada inibidor adicional.
- Incubar as células a 37 °C sob uma atmosfera de 5% de CO2 durante a noite.
- No dia seguinte, infecte as células com IAV (um subtipo de H1N1 ou outro subtipo).
- Para isso, prepare o inóculo do vírus diluindo o estoque de vírus em 400 μL de meio essencial mínimo livre de soro (MEM) (ver Tabela de Materiais) em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,5-3,0 unidades formadoras de placas (pfu)/célula (um fator de duplicação do número de células no cálculo do MOI).
nota: Para infectar células MDCK, suplementar o inóculo do vírus com tosil fenilalanil clorometilcetona (TPCK)-tripsina a uma concentração final de 1 μg / mL.
- Remova o meio de cultura antigo das células (etapa 1.3) e lave as células com 1 mL / poço de MEM 2x sem soro.
- Adicionar 400 μL de inóculo viral (etapa 1.4.1) às células e incubá-las durante 1 h a 35 °C sob uma atmosfera de dióxido de carbono (CO2) a 5%.
- Enquanto isso, dilua um inibidor de caspase (por exemplo, Z-DEVD-FMK), um inibidor de lisossomo (por exemplo, cloreto de amônio, NH4Cl) ou um inibidor de proteassoma (por exemplo, MG132) (consulte a Tabela de Materiais) a uma concentração final de 40 μM, 20 mM ou 10 μM, respectivamente, em MEM sem soro (consulte a Tabela de Materiais). Os dois últimos inibidores servem como controle. Diluir um volume igual do solvente (se não for água) utilizado para reconstituir um dos inibidores em meio isento de soro, como simulação.
- Remova o inóculo do vírus e lave as células como na etapa 1.5 (1x).
- Adicione o MEM sem soro, 1 mL / poço, simulado ou suplementado com um inibidor, às células e incube as células como na etapa 1.6. Este ponto de tempo é considerado como infecção de 0 h.
- Após 24 h, colha as células raspando-as com um êmbolo de seringa de 1 mL (lado de borracha) e transfira-as para um tubo de polipropileno de 1,5 mL.
- Centrifugue o tubo a 12.000 x g por 1-2 min em temperatura ambiente. Colete o sobrenadante usando uma pipeta.
nota: Este sobrenadante pode ser descartado ou usado para um ensaio de placa para medir o título da progênie do vírus liberado.
- Lave o pellet celular com 250 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) por recentrifugação como na etapa 1.11.
- Remova o sobrenadante e lise as células adicionando 80-100 μL de tampão de lise celular (50 mM de cloridrato de Tris (hidroximetil) aminometano (THAM) (Tris-HCl), pH 7,4, 150 mM de cloreto de sódio (NaCl), 0,5% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5% de desoxicolato de sódio, 1% de Triton X-100 e 1x coquetel de inibidor de protease, consulte a Tabela de Materiais) e vórtice.
- Aquecer o tubo a 98 °C durante 10 min para lisar completamente e preparar o lisado celular total. Conservar os lisados a 4 °C para executar os passos 1.15-1.17 no dia seguinte, mas, para obter melhores resultados, termine estes passos no mesmo dia.
- Estime a quantidade de proteína em cada amostra usando um kit de ensaio de ácido bicinconínico (BCA) (consulte a Tabela de Materiais).
- Resolva quantidades iguais de proteína de amostras não infectadas e infectadas por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS padrão (SDS-PAGE) junto com marcadores de peso molecular.
- Transfira a proteína para uma membrana de nitrocelulose ou difluoreto de polivinilideno (PVDF) (consulte a Tabela de Materiais).
nota: A membrana de PVDF pode fornecer um fundo alto em alguns geradores de imagens de western blot; Verifique a compatibilidade.
- Realize western blotting para detectar a proteína de interesse usando o método descrito em outro lugar.
- Compare os níveis de proteína nas pistas de amostra infectadas tratadas com simulado e tratadas com inibidor.
nota: Se o nível de proteína se recuperou na pista de amostra infectada tratada com inibidor de caspase, então a proteína é clivada ou degradada por caspases. Caso contrário, é degradado pelo lisossomo ou proteassoma.
- Quantifique a recuperação de proteínas medindo sua intensidade de banda em cada pista de pelo menos três réplicas do mesmo experimento e normalizando-a com a banda de controle de carga correspondente.
- Use qualquer gerador de imagens contemporâneo e software associado (consulte a Tabela de Materiais) para obter imagens dos western blots e quantificar a recuperação de proteínas.
