1. Avaliação da atividade antimicrobiana
NOTA: Todo o trabalho envolvendo bactérias deve ser realizado em condições estéreis para evitar a contaminação do ensaio ou do laboratório. Todos os meios devem ser autoclavados antes do uso, e os utensílios de plástico e equipamentos, como pipetas, devem ser mantidos estéreis. Recomenda-se que o trabalho seja feito em uma capela de biocontenção (tipo 2).
- Listre os estoques de glicerol de cepas bacterianas apropriadas para o andaime antibiótico em ágar caldo de lisogenia (LB, preparado de acordo com as instruções do fabricante) e cresça durante a noite a 37 ° C.
nota: A escolha da bactéria para testar a atividade antibacteriana deve ser feita com base no andaime antibiótico que está sendo usado. Uma faixa representativa de 5 a 10 bactérias deve ser escolhida das espécies que são conhecidas por serem suscetíveis ao antibiótico, levando em consideração as capacidades logísticas do laboratório. Se possível, bactérias resistentes também devem ser testadas. O protocolo fornecido abaixo funcionará na maioria das bactérias, mas verifique se são necessárias condições especiais (por exemplo, CO2, meios especiais) e faça as alterações necessárias. As bactérias testadas com sucesso usando essas condições incluem estafilococos, estreptococos, bacilos, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Enterococcus faecium.
- Pegue uma única colônia da placa e cultive durante a noite em 5 mL de caldo Mueller-Hinton ajustado para cátions (CAMHB, preparado de acordo com as instruções do fabricante) a 37 ° C.
- Dilua as culturas noturnas ~ 40 vezes em CAMHB e cresça até uma fase intermediária, densidade óptica a 600 nm (OD600) = 0,4–0,8, volume 5 mL).
- Prepare soluções de estoque de cada antibiótico fluorescente a 1,28 mg / mL em água estéril e pipete 10 μL de antibiótico para a primeira coluna de uma placa de 96 poços.
- Adicione 90 μL de CAMHB à primeira coluna e 50 μL a todos os outros poços. Em seguida, execute a diluição serial de 2 vezes na placa.
- Misture bem e, em seguida, dilua as culturas da fase logarítmica intermediária para ~ 106 unidades formadoras de colônias (UFC) / mL e adicione 50 μL a todos os poços, para fornecer uma concentração final de ~ 5 x 105 UFC / mL.
volume de cultura (mL) = (volume médio em mL)/(DO600 x 1.000)
por exemplo, para uma cultura OD600 = 0,5 em um volume de meio desejado de 12 mL, adicione (12/(0,5 x 1.000) = 0,024 mL de cultura a 12 mL de meio
- Cubra as placas com tampas e incube a 37 °C por 18–24 h sem agitar.
- Inspecione visualmente as placas, sendo a CIM o poço de menor concentração, sem crescimento visível.
nota: Consulte a Tabela 1 para alguns exemplos de antibióticos fluorescentes ativos e inativos.
2. Análise do acúmulo de sonda por espectrofotometria
NOTA: Esses tempos de centrifugação foram otimizados para E. coli, portanto, pequenas alterações podem ser necessárias para outras espécies. Dados representativos para o acúmulo de sonda são relatados para a sonda de ciprofloxacina marcada com NBD.
- Risque os estoques de glicerol das cepas bacterianas em ágar LB e cresça durante a noite a 37 ° C.
- Colher uma única colónia da placa e cultivar durante a noite em LB a 37 °C.
- Dilua as culturas durante a noite ~ 50 vezes em meio e cresça até a fase intermediária (OD600 = 0,4–0,8).
- Centrifugar as culturas a 1.470 x g durante 25 min e transvasar os meios.
- Ressuspenda as bactérias em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, centrifugue a 1.470 x g por 15 min.
- Transvasar o meio e ressuspender os pellets lavados em PBS até obter um ODfinal 600 = 2.
- Se desejar, adicione 10,1 μL de cianeto de carbonila 3-clorofenilhidrazona (CCCP, 10 mM em PBS) a 1 mL de bactérias (concentração final de 100 μM) e incube a 37 ° C por 10 min.
nota: O CCCP é um inibidor da bomba de efluxo. A adição de CCCP permitirá examinar o impacto do efluxo.
- Centrifugar as culturas a 18.000 x g durante 4 min a 20 °C e transvasar os meios.
- Adicione 1 mL de solução antibiótica fluorescente (10–100 μM em PBS) ao pellet e incube a 37 ° C por 30 min.
- Centrifugar as culturas a 18.000 x g durante 7 min a 4 °C e decantar os meios.
- Ressuspenda as bactérias em 1 mL de PBS frio e repita a etapa 2.9.
- Repita a etapa 2.10 um total de 4x.
- Se desejar, lise as bactérias adicionando 180 μL de tampão de lise (20 mM de Tris-HCl, pH 8,0 e 2 mM de EDTA sódico) e, em seguida, 70 μL de lisozima (72 mg / mL em H2O).
- Incube a 37 ° C por 30 min, depois congele e descongele 3x (-78 ° C por 5 min, depois 34 ° C por 15 min).
- Sonicar as amostras durante 20 min, depois aquecer a 65 °C durante 30 min.
- Centrifugar as amostras lisadas (18.000 x g, 8 min) e filtrar através de uma membrana filtrante de 10 kDa.
- Lave o filtro 4x com 100 μL de água.
- Transferir o lisado para uma placa preta de 96 poços de fundo plano e medir a intensidade de fluorescência num leitor de placas com comprimentos de onda de excitação e emissão adequados para o fluoróforo (isto é, 7-(dimetilamino)-2-oxo-2H-cromeno-4-ilo [DMACA]: λex = 400 nm, λem = 490 nm; nitrobenzoxadiazol [NBD]: λex = 475 nm, λem = 545 nm).
nota: Consulte a Figura 1 para obter exemplos de análises espectrofotométricas de bactérias usando o antibiótico fluorescente ciprofloxacina marcado com NBD.
