Isolando células T assassinas naturais invariantes de um modelo de camundongo

Resumo

Fonte: Meng, M., et al. Imunoterapia adotiva de células iNKT em camundongos com AR induzida por glicose-6-fosfato isomerase (G6PI).J. Vis. Exp.(2020)

Este vídeo ilustra um método para isolar células T natural killer invariantes, também conhecidas como células iNKT. O procedimento começa com a injeção de um glicolipídio sintético em um camundongo para estimular a ativação e proliferação de células iNKT no baço. Posteriormente, suspensões unicelulares são preparadas a partir do baço e incubadas com complexos de reconhecimento de células iNKT marcados com fluoróforos, seguidos de separação baseada em esferas magnéticas, para isolar as células iNKT.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Obtenção de células T natural killer invariantes (células iNKT) com terapia celular adotiva

1. Indução direcional de células iNKT
   1. Injete camundongos normais por via intraperitoneal com α-galactosilceramida (α-GalCer) (0,1 mg / kg de peso corporal).
2. Isolamento de células iNKT
   1. Três dias após a modelagem, injetar camundongos por via intraperitoneal com pentobarbital sódico a 1% (50 mg/kg de peso corporal) para anestesia. Camundongos adequadamente anestesiados não mostram uma resposta de retirada da pata traseira a um beliscão do dedo do pé.
   2. Isole o baço de um camundongo DBA/1 após injetá-lo por via intraperitoneal com α-GalCer. Prepare uma suspensão unicelular cortando e triturando o baço em uma peneira de 200 malhas.
   3. Lave a suspensão celular com solução salina tamponada com fosfato (PBS), centrifugue a 200 x g por 5 min e descarte o sobrenadante. Repetir.
   4. Ressuspenda as células com 1 mL de sangue total e solução de diluição tecidual. Adicione 3 mL de meio de separação de linfócitos de camundongo e, em seguida, centrifugue as células por 20 min a 300 x g à temperatura ambiente.
   5. Colete a camada de linfócitos brancos leitosos (ou seja, a segunda camada do topo), lave-a 2x com PBS e conte com um contador de células automatizado.
3. Estratégia de seleção positiva de classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) para purificação de células iNKT
   nota: Para o pré-tratamento de tetrâmeros CD1d, 1 mg/mL de α-Galcer foi diluído a 200 μg/mL com 0,5% de Tween-20 e 0,9% de NaCl, e 5 μL da solução resultante foram adicionados a 100 μL da solução de tetrâmero CD1d. A mistura foi incubada por 12 h em temperatura ambiente e colocada a 4 °C para uso. O receptor de células T (TCR) β foi diluído 80x com água deionizada. Todos os outros anticorpos foram usados como solução estoque.
   1. Ressuspenda 10⁷ células com 100 μL de PBS a 4 °C, adicione 10 μL de tetrâmero-ficoeritrina CD1d carregado com α-GalCer (CD1d Tetrâmero-PE) e incube-as a 4 °C por 15 min no escuro.
   2. Lave as células 2x com PBS e ressuspenda-as em 80 μL de PBS.
   3. Adicione 20 μL de anti-PE-MicroBeads e incube-os a 4 °C por 20 min no escuro.
   4. Lave-os 2x com PBS e ressuspenda as células com 500 μL de PBS.
   5. Coloque a coluna de classificação no campo magnético do classificador MACS e enxágue com 500 μL de PBS.
   6. Adicione a suspensão de células da etapa 1.3.4 à coluna de classificação, colete o fluxo e enxágue 3x com tampão PBS.
   7. Remover o campo magnético e recolher as células da coluna de classificação. Neste ponto, adicione 1 mL de tampão PBS à coluna de classificação e empurre rapidamente o êmbolo a uma pressão constante para conduzir as células marcadas ao tubo de coleta e obter células iNKT purificadas. Conte com um contador de células automatizado.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microesferas anti-PE	Miltenyi	130-048-801	Alemanha
Colunas	Miltenyi	Ms	Alemanha
Centrífuga criogênica	Beckman	Allegra® X-15R	América
Tetrâmero-PE CD1d de camundongo	MBL	TS-MCD-1	Japão
Percoll do rato	Solarbio	Pág. 8620	China
Microscópio óptico	Olimpo	Olimpo-II	Japão