Aumentando a transdução viral em células assassinas naturais usando um polímero catiônico

Resumo

Fonte: Nanbakhsh, A., et al. Dextrana aumenta a eficiência da transdução lentiviral de células NK primárias murinas e humanas. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra um ensaio para transdução viral mediada por polímero catiônico em células natural killer (NK). As células são incubadas com vetores de lentivírus transgênicos que codificam uma proteína fluorescente. A adição de um polímero catiônico permite que o vírus se ligue às células e integre seu RNA ao genoma do hospedeiro, expressando a proteína fluorescente. A fluorescência é quantificada para avaliar o aumento da transdução induzido pelo polímero.

Protocolo

1. Transdução de células NK primárias murinas e humanas com lentivírus

1. Suspenda as células NK primárias de camundongo ou humano em uma placa de 24 poços a 0,5 × 10⁵ / mL de meio na presença de sobrenadante de lentivírus de proteína fluorescente verde (GFP) em 5, 10 e 20 multiplicidade de infecção (MOI) e na presença de Pb (8 μg / mL), PS (8 μg / mL) ou dextrano (8 μg / mL).
2. Centrifugue as placas a 1.000 × g por 60 min.
3. Sem decantar o sobrenadante, cultivar as células durante a noite (16-18 h) em uma incubadora a 37 °C infundida com 5,2% de CO₂.
4. Lave com 10 mL de PBS e ressuspenda em 2 mL de meio de cultura completo do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 na presença de interleucina 2 (IL-2, 300 U / mL).
5. Colha as células NK transduzidas no dia 7 batendo suavemente nos frascos.
   1. Ative as células colhidas com concentrações tituladas de mAb do grupo 2D (NKG2D) (A10) antinatural killer ligado à placa, revestindo placas de poliestireno altamente absorventes de proteínas de 96 poços com concentrações de 2,5 μg/mL de mAb anti-NKG2D durante a noite.
   2. Lave cada poço com 100 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) três vezes antes da adição de células NK primárias.
6. Colete sobrenadantes de cultura usando uma pipeta multicanal entre 16 e 18 h após a ativação para quantificar citocinas como o interferon-gama (IFN-γ). Gere curvas padrão usando as citocinas recombinantes fornecidas com kits de ensaio imunoenzimático (ELISA).
7. Testar a viabilidade das células NK utilizando a coloração com anexina-V/7-amino-actinomicina D (7-AAD) e determinar a percentagem de células necróticas entre as células NK transformadas utilizando um citómetro de fluxo.
   1. Para realizar este ensaio, colha as células NK murinas e humanas quatro dias após a transdução, lave duas vezes com 10 mL de PBS frio a 500 × g por 5 min cada e incube com um kit Annexin-V (PE) / 7-AAD.
8. Use o software de citometria de fluxo apropriado para analisar os dados. Selecione a população de células vivas e analise a expressão de GFP (canal de isotiocianato de fluoresceína [FITC]) como uma medida de transdução viral.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
dextrano	Sigma-Aldrich	90-64-91-9
Polibreno (Pb)	Sigma-Aldrich	TR-1003
Sulfato de protamina (PS)	Sigma-Aldrich	pág. 3369
RPMI1640	Corning	10-040-CV
Interferon gama (IFN-γ)	eBiociência	Telefone: 14-7311-85
Solução de coloração de lodido de propídio	Bd	51-66211E
Lipofectamina 3000	Thermo Fisher	L3000015
Isoflurano	Phoenix	NDC 57319-559-05
Células 293T	ATCC	CRL-3216
Balões T75	Corning	Rolamento 430641U
Kits ELISA	Ebiociência	00-4201-56