Transfectando macrófagos primários com mRNA modificado

Resumo

Fonte: Herb, M. et al., Transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA transcrito in vitro. (2019)

Este vídeo demonstra o processo de transfecção de macrófagos primários com mRNA modificado que codifica a proteína fluorescente verde. Esses mRNAs modificados, projetados para reduzir a imunogenicidade e melhorar sua estabilidade, garantem a transfecção bem-sucedida e a subsequente expressão de proteínas fluorescentes verdes, o que é confirmado por meio de microscopia de fluorescência.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

NOTA: Execute todas as etapas usando luvas. Realize todas as etapas de transfecção sob uma capela de fluxo laminar para evitar a contaminação das células. Antes de trabalhar com mRNA, limpe todos os instrumentos, como pipetas, e todas as superfícies com etanol a 70% e/ou um surfactante degradador de RNAse (Tabela de Materiais). Certifique-se de que todos os tubos de reação sejam livres de RNAse e estéreis. Use apenas água estéril e livre de RNAase para diluições. Use exclusivamente ponteiras de pipeta com filtros. Troque as pontas das pipetas após cada etapa de pipetagem.

1. Geração do modelo de DNA

NOTA: O molde de DNA para transcrição de mRNA in vitro usando este protocolo deve conter uma sequência promotora T7 para permitir o acoplamento da RNA polimerase. Se o plasmídeo que contém a sequência de ADN da proteína de interesse já contiver uma sequência promotora de T7 correctamente orientada directamente a montante da sequência de interesse, é necessário efectuar a linearização do plasmídeo (ver passo 1.1). Caso contrário, anexar um promotor T7 à sequência de interesse por reação em cadeia da polimerase (PCR, ver passo 1.2.).

1. Linearização de plasmídeos contendo promotores T7
   1. Linearizar plasmídeos que já contenham uma sequência promotora de T7 correctamente orientada por digestão com uma enzima de restrição a jusante do códon de paragem da sequência em causa. Caso contrário, a transcrição não terminará corretamente após a sequência de interesse.
      NOTA: É melhor usar enzimas de restrição deixando extremidades rombas ou saliências de 5 pés.
   2. Confirme a linearização completa do plasmídeo por eletroforese em gel de agarose do DNA do plasmídeo não digerido versus digerido.
   3. Purifique o DNA do plasmídeo linearizado antes de usá-lo como modelo de DNA para transcrição de mRNA in vitro usando um kit de purificação de DNA (Tabela de Materiais).
2. Fixação do promotor T7 por PCR
   1. Use um primer direto contendo os seguintes componentes (na ordem indicada de 5' a 3'): cerca de 5 bp aleatórios a montante do promotor (por exemplo, GAAAT); a sequência do promotor T7 (TAATACGACTCACTATAG); dois Gs extras para aumentar a eficiência da transcrição (GG); a parte específica da sequência alvo que é homóloga à sequência de plasmídeo ao redor do códon de início.
      nota: Deve ser composto de 3-6 pb a montante da sequência KOZAK e códon de início, a sequência KOZAK e o códon de início (geralmente GCCACC ATG G), 12-18 pb a jusante do códon de início. Se a sequência de interesse ainda não contiver uma sequência KOZAK ou um códon inicial, eles podem ser anexados nesta etapa simplesmente incluindo-os na sequência inicial.
   2. Calcule o t_m do primer direto apenas levando em consideração a peça homóloga à sequência alvo.
   3. Para avaliar a formação de dímeros/grampos de cabelo, use toda a sequência de primers, que pode facilmente exceder 50 pb.
   4. Use um primer reverso localizado em algum lugar a jusante do códon de parada.
      NOTA: Se a sequência de interesse ainda não contiver um códon de parada, ele poderá ser anexado nesta etapa simplesmente incluindo-o na sequência do primer.
   5. Use os primers direto e reverso para realizar uma PCR usando uma polimerase de alta fidelidade com revisão (Tabela de Materiais).
   6. Confirme a geração de um único produto e o tamanho do amplicon por eletroforese em gel de agarose (por exemplo, use um gel de agarose a 1% e corrente constante de 100 V).
   7. Purifique o produto de PCR antes de usar como modelo de ácido desoxirribonucléico (DNA) para transcrição in vitro de ácido ribonucléico mensageiro (mRNA) usando um kit de purificação de DNA.

2. Geração de mRNA

1. Descongele todos os componentes do kit de transcrição de mRNA in vitro (consulte a Tabela de Materiais). Vórtice por 5 s e gire para baixo por 2 s a 2.000 x g. Mantenha no gelo até o uso.
2. Preparar a mistura de reação para a transcrição in vitro do ARNm num tubo de microcentrífuga de 0,5 ml pela seguinte ordem (volume total de 40 μL): 20 μL de mistura 10x análogos anti-tampa reversa/trifosfato de nucleosídeos (ARCA/NTP) (incluído no kit de transcrição de mRNA in vitro); 0,25 μL de trifosfato de 5-metil-citidina (5-mCTP) (concentração final (f.c.) é de 1,25 mM; 50% do CTP total); 0,25 μL de trifosfato de pseudo-uridina (pseudo-UTP) (f.c. é 1,25 milímetro; 50% do total das UTP); X μL de molde de DNA; 2 μL de mistura de RNA polimerase T7 (incluída no kit de transcrição de mRNA in vitro); Y μL de H₂O. livre de RNAse
   NOTA: X é um volume que contém pelo menos 1 μg de DNA. Por exemplo, 1,6 μL de uma solução estoque de 625 ng/μL. Y é o volume sobressalente para o volume total de 40 μL.
3. Vórtice por 5 s e gire para baixo por 2 s a 2.000 x g. Incubar a 37 °C por 30 min a 400 rpm em um misturador térmico para transcrição in vitro.
4. Em seguida, adicione 2 μL de DNase I diretamente na mistura de reação para remoção do DNA molde. Vórtice por 5 s e gire para baixo por 2 s a 2.000 x g.
5. Incubar a 37 °C durante 15 min a 400 rpm num misturador térmico. Tomar uma alíquota de 2 μl para o gel de controlo (passo 3.3) e conservar a -80 °C.
6. Para rejeito de poli(A), adicione os seguintes componentes diretamente na mistura de reação anterior (até um volume final de 50 μL): 5 μL de tampão de reação poli(A) 10x poli(A) e 5 μL de poli(A) polimerase (ambos incluídos no kit de transcrição de mRNA in vitro). Vórtice por 5 s e gire para baixo por 2 s a 2.000 x g.
7. Incubar a mistura a 37 °C durante 30 min a 400 rpm num termomixer. Tomar uma alíquota de 2 μl para o gel de controlo (passo 3.3) e conservar a -80 °C.
8. Para a desfosforilação das extremidades 5' do mRNA, adicione os seguintes componentes diretamente na mistura de reação anterior (até um volume final de 60 μL): 3 μL de H₂O livre de RNAse; 6 μL de tampão de reação da fosfatase antártica 10x; 3 μL de fosfatase antártica (15 unidades para 60 μL de volume de reação). Vórtice por 5 s e gire para baixo por 2 s a 2.000 x g.
9. Incubar a mistura a 37 °C durante 30 min a 400 rpm num misturador térmico.
10. Fosfatase antártica inativada pelo calor por incubação a 80 °C por 2 min.
    nota: O ideal é usar um misturador térmico separado, não espere até que o primeiro misturador atinja a temperatura desejada.

3. Purificação de mRNA

1. Purifique o mRNA transcrito in vitro usando um kit de purificação de RNA dedicado (Tabela de Materiais).
   1. Adicionar X μL de solução de eluição à mistura de reacção de ARNm do passo 2.10. Misture invertendo 5 vezes. Adicione 300 μL de concentrado de solução de ligação. Misture por pipetagem suave 5 vezes.
      NOTA: X é o volume sobressalente para um volume total de 100 μL. Por exemplo, adicione 40 μL de solução de eluição a 60 μL de mistura de reação de mRNA.
   2. Adicione 100 μL de etanol livre de RNAase. Misture por pipetagem suave 5 vezes.
   3. Coloque uma coluna de filtro em um dos tubos de coleta fornecidos. Transfira a mistura de reação de mRNA suavemente para o centro do filtro sem tocar no filtro. Centrifugue a 15.000 x g por 1 min em temperatura ambiente (RT).
   4. Levante cuidadosamente a coluna do filtro e descarte o fluxo no tubo de coleta. Coloque a coluna do filtro de volta no mesmo tubo de coleta.
   5. Adicione 500 μL de solução de lavagem (não se esqueça de adicionar 20 mL de etanol livre de RNAase antes de usar a solução de lavagem pela primeira vez).
   6. Centrifugue a 15.000 x g por 1 min em RT. Repita as etapas 3.1.4-3.1.6 para lavar mais uma vez.
   7. Centrifugue em velocidade máxima (17.900 x g) por 1 min em RT para remover qualquer fluido residual da coluna do filtro. Retire cuidadosamente a coluna de filtro do tubo de coleta. Coloque a coluna de filtro em um novo tubo de coleta.
   8. Adicione 50 μL de tampão de eluição no centro do filtro sem tocar no filtro. Incubar a 65 °C durante 10 min num misturador térmico.
   9. Centrifugue a 15.000 x g por 1 min em RT. Remova a coluna do filtro e descarte-a.
2. Meça a concentração e a pureza do mRNA eluído, por exemplo, usando um espectrofotômetro de microvolume para medir a absorbância a 260 e 280 nm.
   NOTA: Uma proporção A260 / A280 de 1,8-2,1 é indicativa de mRNA altamente purificado.
3. Verificar a presença de um único produto, o comprimento correcto do transcrito e o rejeito de poli(A) analisando as alíquotas das etapas 2.5 e 2.7 por electroforese em gel de agarose em condições de desnaturação (por exemplo, utilizar um gel de agarose a 1,2% contendo 20 mM de ácido 3-(N-morfolino)propanossulfónico [MOPS], 5 mM de acetato de sódio, 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e 20% de formaldeído e passar em 20 mM MOPS, 5 mM de acetato de sódio, 1 mM de EDTA e 0,74 % de formaldeído a 100 V de corrente constante).
4. Conservar o ARNm purificado no tubo de eluição a -80 °C até à transfecção. Se estiver usando apenas pequenas quantidades de mRNA para transfecção, aliquote o mRNA para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
   NOTA: o mRNA pode ser armazenado a -80 °C por cerca de 1 ano.

4. Preparação de macrófagos

1. Eutanásia de camundongos C57/BL6 (usar camundongos do mesmo sexo e de 6 a 24 semanas de idade) por luxação cervical.
   NOTA: Os mesmos camundongos podem ser usados para isolamento de macrófagos primários (PM) (etapa 4.2) e geração de BMDM (etapas 4.3 e 4.4). Para isolamento de PM, use pelo menos dois camundongos. Se apenas o BMDM for gerado, um mouse geralmente é suficiente.
2. Enriquecimento imunomagnético de macrófagos peritoneais.
   1. Encha uma seringa de 10 mL com uma cânula de 0,9 x 40 mm com 8 mL de solução salina tamponada com fosfato gelado (PBS) e 2 mL de ar. Lave a cavidade peritoneal com PBS. O ar formará uma bolha que minimiza o vazamento do PBS.
   2. Colete rapidamente a lavagem peritoneal com a mesma seringa e transfira-a para um tubo de centrifugação cônico de 50 mL. Combine células peritoneais de vários camundongos, se necessário. Mantenha a suspensão celular no gelo.
   3. Centrifugar a suspensão celular a 650 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 5 ml de NaCl a 0,2% durante 30 s para lisar os glóbulos vermelhos.
   4. Adicione 5 mL de NaCl a 1,6% a um volume total de 10 mL para reconstituir as condições isotônicas. Centrifugue a 650 x g durante 5 min a 4 °C.
   5. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 97,5 μL de tampão de classificação magnética de células (MCS) (ácido etilenodiaminotetracético 2 mM [EDTA], albumina de soro bovino a 0,5% [BSA] em PBS) por 1 lavagem peritoneal (por exemplo, se três camundongos foram lavados, ressuspenda em 292,5 μL).
   6. Adicione 2,5 μL de esferas paramagnéticas conjugadas a um anticorpo específico para CD11b por 97,5 μL de suspensão celular (por exemplo, adicione 7,5 μL a 292,5 μL).
   7. Incube no gelo por 15 min a 150 rpm em um agitador orbital.
   8. Centrifugue a suspensão da célula a 650 x g por 5 min a 4 ° C, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet da célula em 1 mL de tampão MCS.
   9. Adicione 4 mL de tampão MCS a um volume total de 5 mL e lave as células pipetando suavemente para cima e para baixo três vezes.
   10. Repita as etapas 4.2.8 e 4.2.9 mais duas vezes para um total de três etapas de lavagem.
   11. Durante as etapas de lavagem, coloque uma coluna LS em um separador de célula magnética (consulte a Tabela de Materiais). Enxágue a coluna com 3 mL de tampão MCS.
       nota: Evite bolhas, pois elas podem entupir a coluna.
   12. Ressuspenda o pellet celular em 1 mL de tampão MCS. Adicione 3 mL de tampão MCS a um volume total de 4 mL e misture pipetando para cima e para baixo três vezes.
   13. Transfira os 4 mL de suspensão celular para a coluna LS enxaguada.
       NOTA: Novamente, evite bolhas, pois elas podem entupir a coluna.
   14. Aguarde até que o reservatório da coluna esteja completamente vazio. Não adicione fluido adicional até que a coluna pare de pingar.
   15. Adicione 3 mL de tampão MCS à coluna. Em seguida, aguarde até que o reservatório da coluna esteja completamente vazio. Repita a etapa 4.2.15 mais duas vezes.
   16. Coloque a coluna LS em um tubo de centrifugação cônico de 15 mL. Aplique 5 mL de tampão MCS na coluna. Aguarde até que 2 mL de fluido tenham passado pela coluna e, em seguida, use o êmbolo para empurrar suavemente a fração restante para dentro do tubo.
   17. Centrifugar a suspensão da célula a 650 x g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
   18. Ressuspenda o pellet celular em 1 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bezerro inativado por calor (FCS) (DMEM+FCS).
   19. Determinar o número de células viáveis contando em solução de azul de tripano em uma câmara de contagem de Neubauer e células-semente em DMEM+FCS em placas de cultura.
       NOTA: Semeie PM a uma densidade de 100.000 células/poço em uma placa de microtitulação de fundo plano. Não use placas tratadas com cultura de tecidos, pois o PM não pode ser separado delas. Em vez disso, use placas não tratadas.
3. Geração de BMDM
   1. Remova a pele e os músculos das patas traseiras usando uma tesoura. Lave cada perna por submersão curta em etanol a 70%.
   2. Separe as pernas e abra as duas extremidades do fêmur e da tíbia cortando com uma tesoura.
   3. Encha uma seringa de 5 mL cheia de uma cânula de 0,6 mm x 30 mm com 5 mL de endotoxina muito baixa (VLE) RPMI 1640 e lave a medula óssea dos ossos abertos em uma placa de cultura.
   4. Combine a medula óssea de vários camundongos, se necessário, repetindo as etapas 4.3.1-4.3.3. Transfira a medula óssea para um tubo de centrifugação cônico de 50 mL.
   5. Centrifugar a suspensão da medula óssea a 650 x g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
   6. Ressuspenda o pellet celular em 5 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (cloreto de amônio a 8,3%, NH₄Cl, 0,1 M Tris) e incube por 5 min em RT para lisar os glóbulos vermelhos.
   7. Centrifugar a suspensão da célula a 650 x g a 4 °C durante 5 min e rejeitar o sobrenadante.
   8. Ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio VLE Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 10% FCS, 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de HEPES, 1% de piruvato de sódio e 10 ng/mL de fator estimulador de colônias de macrófagos recombinantes (M-CSF) (RPMI+++++).
   9. Adicione 4 mL de RPMI+++++ a um volume total de 5 mL.
   10. Prepare 5 placas de Petri não tratadas de 92 mm x 16 mm com cames (consulte Tabela de Materiais) por camundongo, pipetando 7 mL de meio RPMI+++++ em cada placa.
   11. Transfira 1 ml de solução celular para as 5 placas de cultura preparadas e incube a 37 °C e 5% de CO₂.
   12. Após 4 dias, alimente as células adicionando 4 mL de RPMI+++++. Após 6-7 dias, as células da medula óssea são totalmente diferenciadas em DMMO.
4. Colheita de DMO
   1. Remova completamente o meio das placas de cultura. Adicione 5 mL de EDTA 0,2 mM quente em PBS a cada prato.
   2. Raspe suavemente toda a placa com um raspador de células para soltar o BMDM. Combine as suspensões celulares em um tubo de centrifugação cônico de 50 mL.
   3. Lave todos os 5 pratos novamente. Use o mesmo volume de 5 mL de EDTA 0,2 mM quente em PBS para todos os 5 pratos. Combine esta suspensão celular com a da etapa anterior.
   4. Centrifugar a suspensão da célula a 650 x g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
   5. Ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio VLE RPMI 1640 suplementado com 10% de FCS, 1% de HEPES, 1% de piruvato de sódio e 10 ng/mL de M-CSF recombinante, mas sem antibióticos (RPMI⁺⁺⁺⁺).
   6. Determinar o número de células viáveis contando em solução de azul de tripano em uma câmara de contagem de Neubauer e células-semente em RPMI⁺⁺⁺⁺ em placas de cultura.
      nota: Semeie BMDM a uma densidade máxima de 50.000 células/poço em uma placa de microtitulação de fundo plano. Não use placas tratadas com cultura de tecidos, pois o BMDM dificilmente pode ser separado delas. Em vez disso, use placas não tratadas.

5. Transfecção de macrófagos com mRNA

1. Calcule o volume necessário de tampão de transfecção de mRNA.
   nota: O volume de tampão de transfecção de mRNA necessário depende do tamanho do poço: use 200 μL para transfecção em uma placa de 6 poços, 100 μL em uma placa de 12 poços e assim por diante. Sempre adicione um pouco de volume sobressalente por causa da perda de pipetagem (mas não muito, para evitar a diluição indevida do mRNA). Por exemplo, use 450 μL em vez de 4 x 100 μL = 400 μL para transfectar em 4 poços de uma placa de 12 poços.
2. Calcule o volume necessário de reagente de transfecção de mRNA. O reagente de transfecção de mRNA é adicionado na proporção de 1:50. Por exemplo, 9 μL de reagente de transfecção de mRNA são necessários para um volume final de 450 μL.
3. Calcule a quantidade total de mRNA necessária. Pelo menos 100 ng por 100.000 macrófagos são necessários para uma transfecção eficiente, 200 ng funcionam ainda melhor (por exemplo, 800 ng de mRNA para transfectar 400.000 macrófagos).
   1. Multiplique a quantidade calculada de mRNA necessária pelo número total de poços que precisam ser transfectados (por exemplo, 4 poços com 400.000 macrófagos cada: 4 x 800 ng = 3.200 ng de mRNA são necessários no total para todos os poços). Por exemplo, se o seu estoque de mRNA for de 426,8 ng/μL, 7,49 μL são necessários para a transfecção ideal de 4 poços com 400.000 macrófagos cada.
4. Adicione o volume calculado de tampão de transfecção de mRNA (etapa 5.1.) menos os volumes do reagente de transfecção de mRNA (etapa 5.2) e do mRNA (etapa 5.3) a um tubo de reação. Por exemplo, 450 μL - 9 μL - 7,49 μL = 433,51 μL.
5. Descongele o estoque de mRNA e misture-o girando suavemente o tubo de eluição. Adicione o volume calculado de mRNA (etapa 5.3) ao tubo de reação com tampão de reação de mRNA (no exemplo apresentado acima: 7,49 μL em 433,51 μL).
6. Vórtice por 5 s e gire para baixo por 2 s a 2.000 x g.
7. Vórtice o reagente de transfecção de mRNA por 5 s e gire para baixo por 2 s a 2.000 x g.
8. Adicione o volume calculado do reagente de transfecção de mRNA (etapa 5.2) ao tubo de reação que contém o tampão de transfecção de mRNA e o mRNA (no exemplo apresentado acima: 9 μL de reagente de transfecção de mRNA).
9. Vortex a mistura de transfecção por 5 s e gire para baixo por 2 s a 2.000 x g.
10. Incubar por 15 min em RT.
11. Entretanto, substituir o meio de cultura dos macrófagos por um meio de cultura fresco e quente (ver passos 4.2.18 e 4.4.5).
12. Após a etapa de incubação 5.10, adicione a mistura de transfecção aos poços contendo os macrófagos em um volume apropriado para o tamanho do poço (consulte a etapa 5.1). Adicione a mistura de transfecção gota a gota em um círculo de fora para o meio do poço.
13. Balance suavemente a placa, primeiro na direção vertical e depois na horizontal para garantir uma distribuição uniforme da mistura de transfecção no poço. Em seguida, incubar a 37 °C e 5 % de CO₂. A síntese da proteína codificada pelo mRNA transfectado começará logo após a transfecção. Para melhores resultados, incube por pelo menos 6 h.
14. Após a incubação, analise a eficiência da transfecção por microscopia de (imuno)fluorescência, citometria de fluxo ou immunoblot, ou use os macrófagos transfectados para o experimento de escolha.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
5-metil-CTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1138S	conservados a -20 °C
Fosfatase antártica	BioLabs da Nova Inglaterra	M0289	conservados a -20 °C
Tampão de reação da fosfatase antártica (10X)	BioLabs da Nova Inglaterra	B0289	conservados a -20 °C
anticorpo anti-NEMO/IKKγ	Invitrogen	MA1-41046	conservados a -20 °C
anticorpo anti-β-actina	Sigma-Aldrich	Rolamento A2228	conservados a -20 °C
Placas de Petri 92,16 mm com cames	Sarstedt	8,21,473	armazenado no RT
Microesferas CD11b camundongo e humano	Miltenyi Biotec	130-049-601	conservado a 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor primer direto	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3', armazenado a -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor primer reverso	Sigma-Aldrich		5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, armazenado a -20 °C
Kit de purificação de DNA: Kit de purificação de PCR QIAquick	Qiagen	Rolamento 28104	armazenado no RT
eGFP + T7-Promotor de primer direto	Sigma-Aldrich		5'-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3', armazenado a -20 °C
eGFP + T7-Promotor primer reverso	Sigma-Aldrich		5'-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3', armazenado a -20 °C
Tampão de digestão rápida (10X)	Thermo Científico	B64	conservados a -20 °C
FastDigest XbaI	Thermo Científico	FD0684	conservados a -20 °C
Polimerase de alta fidelidade com revisão: Q5 DNA-polimerase de alta fidelidade	Nova Inglaterra Biolabs Inc	M0491S	conservados a -20 °C
Primário direto IKKβ + T7-Promotor	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, armazenado a -20 °C
Primário reverso IKKβ + T7-Promotor	Sigma-Aldrich		5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, armazenado a -20 °C
kit de transcrição de mRNA in vitro: kit de mRNA HiScribe T7 ARCA (com rejeito de poliA)	BioLabs da Nova Inglaterra	E2060	conservados a -20 °C
Colunas LS	Miltenyi Biotec	130-042-401	armazenado no RT
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	armazenado no RT
Tampão e reagente de transfecção de mRNA: jetMESSENGER	Transfecção Polyplus	409-0001DE	conservado a 4 °C
Plasmídeo IKKβ IKK-2S177/181E mutante	Addgene	11105	conservados a -20 °C
Plasmídeo mutante NEMOC54/347A	Addgene	Nº 27268	conservados a -20 °C
plasmídeo pEGFP-N3	Addgene	Nº 62043	conservados a -20 °C
Poli (I: C)	Calbioquímica	528906	conservados a -20 °C
plasmídeo pPGK-Cre			F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, Novas variantes de Cre recombinase induzível: Um novo mutante da proteína de fusão Cre-PR exibe sensibilidade aprimorada e uma faixa expandida de indutibilidade. Ácidos nucléicos Res. 29, 47e (2001). conservados a -20 °C
Pseudo-UTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1139S	conservados a -20 °C
Separador QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-090-976	armazenado no RT
Anticorpo CD11b anti-camundongo de rato, conjugado com APC	BioLegend	101212	conservado a 4 °C
Anticorpo F4/80 anti-camundongo de rato, conjugado com PE	eBiociência	12-4801-82	conservado a 4 °C
M-CSF recombinante	Peprotech	315-02	conservados a -20 °C
Kit de purificação de RNA: kit de limpeza de transcrição MEGAclear	ThermoFisher Scientific	AM1908	conservado a 4 °C
Surfactante degradador de RNAse: RnaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020	armazenado no RT
LPS ultrapuro de E.coli O111:B4	Invivogen		conservados a -20 °C
Plasmídeo IKKβ do tipo selvagem	Addgene	11103	conservados a -20 °C
Plasmídeo NEMO do tipo selvagem	Addgene	Nº 27268	conservados a -20 °C