NOTA: O protocolo a seguir descreve as etapas necessárias para eliminar células específicas usando fotoimunoterapia de infravermelho próximo (NIR-PIT). Controles e outros detalhes sobre NIR-PIT e viabilidade celular podem ser encontrados em outros lugares.
1. Conjugação de Infravermelho 700 (IR700) em Anticorpos Monoclonais (mAb)
- Prepare o mAb de interesse a 2-5 mg / ml em solução de hidrogenofosfato dissódico 0,1 M (Na2HPO4) (pH 8,6).
- Misture 6,8 nmol de mAb com 30,8 nmol de 10 mM IR700 em solução 0,1 M Na2HPO4 (pH 8,6) em um tubo de microcentrífuga e incube em RT por 1 hora, coberto com papel alumínio.
- Lave a coluna PD-10 (consulte Tabela de Materiais/Equipamentos) com 15 ml de PBS, duas vezes. Carregue a amostra da etapa 1.2.
- Purificar a mistura através da coluna PD-10 por eluição PBS de acordo com as instruções do fabricante.
NOTA: Aqui, a eluição estava ao longo da cor da banda de IR700. Para uma amostra de 300 μl, a fração de eluição PBS é tipicamente entre 2,5 ml e 4,4 ml.
- Determinar a concentração de proteínas com a coloração de Coomassie medindo a absorção a 595 nm com um espectrofotómetro. Determinar a concentração de IR700 com absorção a 689 nm para confirmar o número de moléculas de fluoróforo conjugadas a cada molécula de mAb.
NOTA: É importante determinar um número ideal de conjugação de moléculas de IR700 em 1 mAb com um espectrofotômetro. Geralmente, cerca de 3 moléculas de IR700 em 1 molécula de mAb são ideais para trabalhos in vitro e in vivo. Os métodos de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e eletroforese em gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) podem ser usados para confirmar se o mAb e o IR700 estão ligados ou não.
- Conservar a 4 °C após determinação da concentração de proteínas.
2. Preparação de Cultura de Células 3D Mistas (Esferóide Misto)
- Aplique água estéril (cerca de 1 ml) na seção do reservatório da placa das placas suspensas.
- Prepare várias proporções dos tipos de células de interesse - células de proteína fluorescente verde de luciferase A431 (A431-luc-GFP) e células de proteína fluorescente vermelha 3T3 (3T3-RFP) - com cada amostra contendo 5.000 células no total, suspensas em 50 μl de meio de cultura.
NOTA: Prepare proporções 1:100, 10: 100, 25:100, 50:100, etc. de tipos de células de interesse em meios de cultura, dependendo do tipo de célula.
- Incube a mistura por 5-7 dias na placa suspensa de 96 poços em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de dióxido de carbono. Troque os meios de cultura a cada 2 dias. NOTA: Para fazer o esferóide 3D com precisão, manuseie a placa com cuidado, pois as gotas contendo células caem facilmente antes de formar formas 3D.
- Observe a morfologia e o tamanho dos esferóides usando um microscópio de campo claro invertido com ampliação de 10X a 40X. NOTA: Embora dependa dos tipos de células e do tamanho da gota suspensa, certifique-se de que o diâmetro do esferóide seja de cerca de 400-600 μm após 7 dias de incubação na placa suspensa de 96 poços.
3. NIR-PIT in vitro para cultura de células 3D mistas
- Troque o meio das placas suspensas para 10 μg / ml de meio contendo conjugado anticorpo-fotoabsorvedor (APC) e incube por 6 horas em uma incubadora umidificada a 37 ° C e 5% de dióxido de carbono.
- Após 6 horas de incubação, lave o esferóide duas vezes com meios de cultura frescos (sem vermelho de fenol). Transfira suavemente o esferóide para uma placa de 50 mm com fundo de vidro com 100 μl de meio de cultura fresco sem vermelho de fenol usando uma ponta de pipeta estéril de 200 μl com a ponta cortada. Coloque um esferóide em cada prato.
- Observe o esferóide com um microscópio de campo claro invertido para detectar a mudança de morfologia. Para observar os repórteres ópticos (por exemplo, GFP e RFP) use um microscópio de fluorescência com as seguintes configurações de filtro: GFP — filtro de excitação de 469 nm e filtro de emissão de 525 nm; RFP — Filtro de excitação de 559 nm e filtro de emissão de 630 nm.
- Coloque o diodo emissor de luz (LED) acima do prato com fundo de vidro para irradiação.
NOTA: Os esferoides podem ser expostos à luz NIR no microscópio ou na coifa laminar.
- Meça a densidade de potência da luz NIR com um medidor de potência óptica. De acordo com esta medição, irradie a luz NIR através de diodos emissores de luz (LEDs) que emitem luz em comprimentos de onda de 670 a 710 nm a 2 J/cm2.
NOTA: A luz LED pode penetrar na profundidade máxima de aproximadamente 5 polegadas. Os efeitos citotóxicos do NIR-PIT dependem apenas da energia fornecida, independentemente da densidade de potência e da duração da exposição.
- Após a irradiação, transferir o esferóide para uma nova placa suspensa com 50 μl de meios de cultura frescos e incubar durante 1 dia numa incubadora humidificada a 37 °C e 5% de dióxido de carbono.
- Transfira suavemente o esferóide para um prato com fundo de vidro com 100 μl de meio de cultura fresco (sem vermelho de fenol) usando uma ponta de pipeta estéril de 200 μl com a ponta cortada. Observe o esferóide com um microscópio de fluorescência 1 dia após NIR-PIT usando as configurações de filtro descritas na etapa 3.3.
- Detectar células mortas adicionando iodeto de propídio ao meio a uma concentração final de 2 μg/ml ou por perda de fluorescência citoplasmática de GFP usando um microscópio de fluorescência (Figura 1B).
- Repita as etapas 3.1 a 3.6 se as células-alvo não forem completamente eliminadas.
