Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto. Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Geração de camundongos HIS
- Criação de camundongos BALB/c -Rag2null Il2RγCnull SirpαNOD (BRGS)
nota: Esta cepa é extremamente imunodeficiente, sem células T, B ou natural killer (NK). Portanto, medidas rigorosas devem ser usadas para prevenir infecções oportunistas. Mantenha a colônia em uma dieta contendo trimetoprima e sulfadiazina em um esquema alternado de 2 semanas com uma dieta normal. Mantenha no mais alto nível de precaução o espaço de alojamento possível (por exemplo, uma instalação de chuveiro com barreira com acesso limitado).
- Manter colônias de camundongos homozigotos BALB/c -Rag2null Il2RγCnull SirpαNOD (BRGS) e BALB/c Rag2null Il2RγCnull SirpaBalb/c (BRG) como reprodutores.
- Raça BRGSN/N×BRGB/B para gerar filhotes BRGSB/N, para serem usados como receptores de células-tronco humanas. Nesta colônia, os BRGSB/N são mais saudáveis que os BRGSN/N e enxertam em níveis equivalentes (mais que os BRG).
- Isolamento de células-tronco humanas CD34+ do sangue do cordão umbilical (CB)
nota: Nenhum antibiótico é usado para este procedimento. Portanto, uma boa técnica estéril é imperativa.
- Coloque um suporte de tubo cônico de 50 mL, bem como 3 tubos cônicos de 15 mL e ~ 10 mL de 50 mL em um gabinete de biossegurança esterilizado (BSC). Pulverize uma bolsa de coleta de sangue com etanol 70% e deixe secar no BSC.
- Calcule o número de tubos cônicos de 50 mL necessários para o isolamento do gradiente de densidade CB = volume CB/15, arredondado para cima e para um número par de tubos. Calcule o volume de sangue por tubo = volume CB/número de tubos. Despeje o sangue cuidadosamente da bolsa CB em cada tubo cônico; isso é um máximo de 15 mL por tubo. Use um pipetador automático e uma pipeta sorológica de 25 mL para misturar o sangue 1:1 com PBS estéril, pipetando para cima e para baixo.
- Use uma pipeta automática em baixa velocidade e uma pipeta sorológica de 10 mL para cobrir lentamente o sangue com solução de gradiente de densidade de 1,077 g/mL em temperatura ambiente (RT) (consulte a Tabela de Materiais) sem perturbar a interface. Evite que a ponta da pipeta toque no fundo do tubo. Repita para todos os tubos. Em seguida, centrifugar durante 30 minutos a 850 x g, sem travagem, a RT para garantir a manutenção do gradiente de densidade.
- Visualize o revestimento leucocitário celular no topo do gradiente de densidade de 1,077 g / mL como uma camada branca turva. Remover e rejeitar a camada de plasma até cerca de 10 ml acima do revestimento leucocitário utilizando uma pipeta serológica de 25 ml e um pipetador automático.
- Colete o casaco buffy com uma transferência estéril ou pipeta sorológica. Use a pipeta como uma espátula para raspar as células da lateral do tubo cônico enquanto solta o bulbo (ou pipeta lentamente) para puxar as células para cima. Combine as camadas buffy de dois tubos cônicos de 50 mL em um novo tubo cônico de 50 mL.
- Lave as células despejando 45 mL de solução salina balanceada estéril de Hanks (HBSS) contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) em cada tubo cônico. Centrifugue por 11 min a 360 x g em RT.
- Aspire o meio de lavagem até o pellet em todos os tubos. Use uma pipeta sorológica de 10 mL e um pipetador automático para ressuspender o primeiro pellet em 10 mL de HBSS contendo 2% de FBS. Ressuspenda cada pellet nos mesmos 10 mL de HBSS e enxágue cada tubo com mais 10 mL de HBSS para coletar todas as células em um único tubo.
- Despeje 45 mL de HBSS estéril contendo 2% de FBS no tubo cônico. Centrifugar durante 10 min a 360 x g, a 4 °C.
- Aspire o tampão de lavagem até o pellet da célula e ressuspenda o pellet em 20 mL de tampão separador de célula magnética (consulte a Tabela de Materiais). Remover uma pequena alíquota para contar as células com um hemacitómetro a uma diluição de 1:20 em azul de metileno. Adicione o número de células azuis e brancas. Centrifugar a 360 x g, por 10 min a 4 °C.
nota: Este protocolo usa tecnologia de esferas magnéticas (consulte a Tabela de Materiais). O protocolo pode ser modificado para uso com qualquer tecnologia de separação celular, com pureza e rendimento suficientes das células-tronco CD34+.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células CD34+ isolado do sangue do cordão umbilical em 300 μL de tampão separador de células magnéticas por 1 x 108 células. Adicione 100 μL de reagente bloqueador do receptor Fc (FcR) primeiro e, em seguida, 100 μL de esferas magnéticas CD34 + por 1 x 108 células. Incubar a 4 °C durante 30 min (sem gelo).
- Adicione 5 mL de tampão separador de célula magnética por 1 x 108 células e gire a 360 x g por 10 min a 4 ° C. Repita a etapa de lavagem e ressuspenda o pellet em 500 μL de tampão separador de célula magnética por 1 x 108 células em um tubo cônico de 15 mL rotulado como "não fracionado".
- Rotule mais dois tubos cônicos de 15 mL "CD34-" e "CD34+". Coloque os três tubos cônicos de 15 mL (não fracionados, CD34 e CD34 +) nos slots A1, B1 e C1, respectivamente, em um rack de resfriamento (consulte a Tabela de Materiais). Separe as células usando o programa de seleção positiva de duas colunas em um separador automático de células magnéticas (consulte Tabela de Materiais) em um BSC, de acordo com as instruções do instrumento do fabricante.
- Expansão e congelamento de células-tronco humanas CD34+
- Alíquota de 10 μL da suspensão de células CD34+ recuperada (2 mL) em lâmina de hemocitômetro e contagem das células com aumento de 10x. Calcule o número total de células CD34+ multiplicando a contagem de células por 2 x 104. Divida o número total de células CD34+ por 250.000 para calcular o número de frascos a serem congelados (50.000 células por filhote de camundongo antes da expansão in vitro).
- Prepare o soro fetal de bezerro (FCS) a 10% do meio CB Iscove (mais 1 mL extra para perda de filtragem), suplementado com fator de células-tronco de 40 ng/mL, ligante de tirosina quinase 3 semelhante a FMS de 20 ng/mL (Flt3L) e interleucina-6 de 10 ng/mL (IL-6) e passe por um filtro de 0,22 μm. Ressuspenda as células CD34+ a 100.000 por mL de meio CB e incube a 37 °C. No dia 3, adicione um volume equivalente de meio CB sem citocinas ao frasco contendo as células e o meio CB com citocinas.
nota: A adição dessas citocinas ao meio CB promove a sobrevivência e a expansão das células CD34+, evitando a diferenciação.
- Colha as células CD34+ expandidas no dia 5. Pipetar a suspensão celular para cima e para baixo e recolher num tubo cónico de 50 ml. Adicionar meio CB suficiente para cobrir o fundo do balão. Usando um raspador de células, raspe todo o fundo do frasco. Colete todos os meios no mesmo tubo de 50 mL e centrifugue a 360 x g por 11 min.
- Ressuspenda as células em 2 mL de meio CB. Guarde a gota final da pipeta em uma placa de 96 poços para contagem. Dilua as células 1:1 em azul de tripano e adicione 10 μL ao hemacitômetro, depois conte e calcule a média das células de quatro quadrantes. Calcule o número total de células CD34+ multiplicando a contagem de células por 4 x 104 e registre a viabilidade.
- Fazer n+1 ml de meio de congelação, em que n é o número de frascos para injetáveis de congelação calculado no passo 1.3.1. Prepare o meio de congelamento adicionando 10% (v / v) de dimetilsulfóxido (DMSO) ao FBS e mantenha no gelo. Rotule os criogenianos com CB#, CD34+ d5 e data.
- Centrifugar as células CD34+ a 360 x g durante 10 min a 4 °C. Aspirar o meio até ao sedimento e ressuspender o sedimento em meio de congelação. Alíquota de 1 mL de suspensão celular para cada frasco para injetáveis e divida o restante igualmente entre os frascos. Adicione os frascos a um freezer de células de isopropanol resfriado a 4 ° C, coloque a -80 ° C e transfira para nitrogênio líquido para armazenar por >90 dias.
- Irradiação de filhotes de camundongos
- Colete os filhotes BRGSB/N, 1-3 dias após o nascimento, em uma caixa plástica autoclavada com acolchoamento. Adicione uma pequena quantidade de roupa de cama com os filhotes. Rotule a caixa com o número da gaiola e o número de filhotes.
- Configure o irradiador (consulte a Tabela de Materiais) para uma dose de 300 rad. Coloque a caixa de filhotes no irradiador e exponha-os a 300 rad. Leve os filhotes de volta para a gaiola, coloque-os em uma pilha e cubra com a cama.
- Injeções de filhotes e preparação de células CD34+
- Comece a preparação das células CD34+ ~3 h após a irradiação. Aqueça 10 mL de mídia CB em um tubo cônico de 50 mL. Execute todas as etapas em um BSC estéril.
- Recupere um frasco de células CD34+ expandidas e congeladas in vitro para cada quatro a seis filhotes para injetar. Descongele rapidamente a 55 °C, até que apenas uma pequena quantidade de gelo seja visível, e adicione as células ao meio CB aquecido (o frasco ainda deve estar frio ao toque). Use 1 mL de meio para enxaguar cada frasco e gire as células a 360 x g por 12 min a 4 ° C.
NOTA: Descobriu-se que o descongelamento rápido a 55 ° C produz melhor viabilidade celular (90% -95%) do que o descongelamento a 37 ° C.
- Aspire o meio com cuidado. Ressuspenda o pellet (pequeno) em 2 mL de meio CB, misture suavemente e adicione ~ 30 μL da suspensão celular a um único poço em uma placa de contagem. Diluir 1:1 em azul de tripano, adicionar 10 μL a um hemocitômetro e contar e calcular a média das células de quatro quadrantes.
- Calcule o número total de células CD34+ multiplicando a contagem de células por 4 x 104 e, em seguida, registre a viabilidade. Gire a 360 x g por 12 min a 4 °C.
- Aspire o meio com cuidado e ressuspenda o pellet celular em 100 μL de PBS estéril por n + 1 filhotes para injetar, resultando em 250.000-450.000 células CD34 + por camundongo. Coloque o tubo cônico no gelo em um recipiente de transporte e viaje para o viveiro para injeção de filhotes.
- Traga uma lâmpada de calor, fraldas, seringa de 1 mL, agulha de 18 G, agulha de 30 G e a preparação de células CD34 + em recipientes estéreis para o biotério BSC. Coloque uma fralda estéril ~ 2 pés embaixo do calor lamp. Recupere a gaiola com a areia a ser injetada e coloque-a no BSC.
- Monte a seringa com uma agulha chanfrada de 18 G. Combinando o ângulo do tubo cônico com o chanfro da agulha, misture suavemente e puxe a suspensão celular. Coloque os filhotes na fralda para aquecer (observe o superaquecimento). Remova o ar da seringa e substitua a agulha de 18 G pela agulha de 30 G e, em seguida, empurre cuidadosamente a seringa até que a suspensão celular esteja na ponta da agulha.
nota: Alternativamente, uma seringa de insulina pode ser usada.
- Leve um filhote de cada vez até a borda da fralda, longe da lâmpada de calor. Imobilize o filhote de lado sob o polegar e o indicador, permitindo uma visão clara do rosto. Observe a veia na bochecha sob onde a orelha estará. Insira a agulha superficialmente na veia (IV) mais próxima do olho e injete lentamente 50 μL de células.
- Verifique se uma bolha está se formando a partir de uma injeção subcutânea. Em caso afirmativo, insira a agulha mais profundamente e prossiga para injetar células. Uma pequena gota de sangue/hematoma será visível quando for bem-sucedido.
- Com o filhote ainda imobilizado, execute uma injeção intra-hepática (IH) com mais 50 μL de células (100 μL no total por filhote de IV+IH). O fígado pode ser visualizado como uma mancha escura entre a faixa branca de leite e a caixa torácica. Coloque o filhote injetado em uma fralda mais longe dos filhotes não injetados e aqueça.
nota: A injeção IV resulta em melhor quimerismo a longo prazo do que a injeção de IH sozinha, mas as injeções IV nem sempre são bem-sucedidas. Portanto, dividir a injeção entre IV e IH garante o enxerto em uma porcentagem maior de camundongos.
- Repita as injeções de veias faciais e IH para todos os filhotes. Limpe todo o sangue, devolva os filhotes ao ninho em sua gaiola e cubra com roupas de cama.
