Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Inoculação de células
- Preparação de células e animais
- Certifique-se de que a linhagem celular seja mantida no meio recomendado. Por exemplo, mantenha a linhagem celular WEHI 164 em meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 2 mM de L-glutamina, 10% de soro fetal bovino, 20 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES), 0,05 mM de 2-mercaptoetanol, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina.
nota: Células de passagem pelo menos 3 e até 5 vezes após serem removidas do armazenamento criogênico. Para garantir a viabilidade celular ideal, as células devem ser divididas quando estiverem entre 70-80% confluentes. As linhagens celulares tumorais devem ser testadas para micoplasma, pois a infecção pode alterar o crescimento celular e influenciar a resposta imune in vivo.
- Um dia antes da inoculação, raspe os camundongos no flanco inferior direito usando uma tesoura.
nota: Camundongos BALB/c fêmeas, com idade entre 8-12 semanas, com peso normal (16 -22 gramas) foram utilizados neste experimento.
- No dia da inoculação, colher células WEHI 164 quando 70-80% confluentes por tripsinização.
- Aspire o meio de cultura dos frascos de cultura de tecidos e, em seguida, adicione solução tamponada com fosfato estéril (1x PBS), para remover vestígios remanescentes de soro fetal bovino (FBS).
- Aspirar o PBS dos balões de cultura de tecidos. Adicione 3 ml de tripsina a 0,05% (para um balão T75) e, em seguida, agite o balão de modo a que toda a superfície do balão com células seja coberta por tripsina.
- Incubar o balão a 37 °C, incubadora de CO2 a 5% durante 3 min. Verificar as células periodicamente, batendo nas laterais do balão para ver se as células se deslocaram.
- Remover frascos da incubadora de cultura de células e adicionar 5 mL de meio suplementado com FBS para neutralizar a tripsina.
nota: Não deixe as células na tripsina por mais tempo do que o necessário, pois isso pode danificar as células e levar à baixa viabilidade celular.
- Suspensão de pipeta várias vezes para obter uma suspensão de célula única. Transfira a suspensão da célula para um tubo de centrífuga cônico.
- Células de pellets girando a 350 x g por 3 min.
- Lave as células três vezes em 1x PBS.
- Ressuspenda as células em 50 mL de PBS estéril 1x e lave as células pipetando a suspensão da célula para cima e para baixo. Células de pellets girando a 350 x g por 3 min.
- Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 15 mL de PBS 1x estéril. Lave as células pipetando a suspensão da célula para cima e para baixo. Células de pellets girando a 350 x g por 3 min.
- Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em exatamente 10 mL de PBS 1x estéril. Lave as células como na etapa 1.1.4.2 e transfira uma pequena quantidade (aproximadamente 100 μL) de suspensão de células para um tubo de centrífuga para contagem. Células de pellets girando a 350 x g por 3 min.
- Determine o número de células usando o método de exclusão Trypan blue usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado. Ressuspenda as células em PBS estéril 1x a uma concentração de 5 x 106 células/mL. Mantenha a suspensão celular no gelo.
nota: A viabilidade das células tumorais deve ser igual ou superior a 80% para garantir o crescimento tumoral reprodutível.
- Inoculação subcutânea
- Misture bem a suspensão celular e encha uma seringa com uma agulha de 26 G com 100 μL de suspensão celular (5 x 105 células) em 1x PBS estéril. Repita a mistura de células antes de carregar a próxima seringa.
nota: Mantenha as células no gelo durante todo o procedimento para manter a viabilidade.
- Restrinja o mouse adequadamente, garantindo o acesso ao flanco inferior direito. Inocule o camundongo por via subcutânea no flanco inferior direito raspado.
nota: Certifique-se de que a inoculação não esteja no peritônio levantando ligeiramente a agulha, que deve ser visível sob a pele. Um nódulo semelhante a uma bolha deve se formar sob a pele após a inoculação.
- Monitorizar os ratinhos conforme exigido pela aprovação ética aplicável e realizar a ressecção cirúrgica quando os tumores atingirem um tamanho de cerca de 50 mm2.
2. Ressecção cirúrgica parcial do tumor
NOTA: Este protocolo requer DOIS pesquisadores; um para procedimentos cirúrgicos (CIRURGIÃO) e outro para monitoramento de camundongos (ASSISTENTE).
- Configuração da cirurgia
- No dia 12 após a inoculação, quando os tumores atingirem um tamanho de aproximadamente 50 mm2, administre camundongos com 100 μL (0,1 mg / kg) de buprenorfina s.c. na nuca, 30 minutos antes da cirurgia.
- Configure a área cirúrgica com uma almofada térmica coberta com um casaco de bancada e configure um cone nasal para anestesia. Esterilize as ferramentas cirúrgicas antes do uso e entre cada animal usando um esterilizador de esferas de calor, permitindo que as ferramentas esfriem antes do uso. Tenha os seguintes equipamentos cirúrgicos limpos e de fácil acesso: clorexidina, cotonete, gaze, gel para os olhos, duas pinças curvas, tesoura, aplicador de clipe, removedor de clipe e recargas de clipe (Figura 1A, 1B).
- Aqueça a câmara de aquecimento a 37 °C e coloque outra almofada térmica para recuperação (Figura 1C). Coloque as ferramentas esterilizadas em uma superfície estéril, como almofadas autoclavadas.
- anestesia
- Coloque o camundongo na câmara de indução e anestesie o camundongo com isoflurano a 4% (4% em oxigênio a 100% a uma taxa de fluxo de 1 L / min) até que a taxa de respiração diminua para aproximadamente 60 respirações por minuto (1 por segundo) (isso geralmente leva <1 min).
nota: Não deixe o rato na câmara por muito tempo, pois isso pode levar à asfixia e à morte. Tenha apenas um camundongo sob anestesia por vez.
- Transfira o mouse para a almofada de calor na mesa de cirurgia, coloque o mouse com o nariz no cone do nariz e mantenha o estado anestésico com isoflurano a 3-4% em oxigênio a 100% a uma taxa de fluxo de 0,5 L/min. Monitore a frequência respiratória para garantir que a profundidade da anestesia seja mantida.
nota: O ASSISTENTE deve monitorar a respiração do camundongo durante toda a cirurgia para garantir que o nível correto de anestesia seja mantido. Diminua a concentração do anestésico se a respiração ficar muito lenta ou aumente a concentração se a profundidade da anestesia for muito rasa. Se o camundongo começar a ofegar, remova o camundongo do cone do nariz, diminua a concentração de anestésico e espere até que a respiração se normalize antes de colocá-lo no cone do nariz novamente.
- Realize um "teste de pinça" e um "teste de reflexo da córnea" para garantir que o camundongo esteja totalmente anestesiado antes de iniciar a cirurgia.
nota: O movimento de qualquer parte do mouse é uma indicação de que o mouse não está totalmente anestesiado. O animal deve receber imediatamente anestésico adicional, aumentando a concentração do anestésico.
- Cubra os olhos do rato com uma pequena quantidade de gel oftálmico para evitar o ressecamento dos olhos.
- Procedimento cirúrgico
- Esfregue a área cirúrgica 3 vezes com clorexidina alcoólica. Com uma pinça e uma tesoura, faça uma incisão reta de 1 cm ao longo do lado dorsal, a 3 mm de distância do tumor (Figura 2A, 2B).
nota: Padronizar a incisão para 1 cm em cada camundongo (usando uma régua) permite uma avaliação uniforme da cicatrização de feridas entre camundongos. A localização da incisão a 3 mm de distância do tumor permite a terapia adjuvante intratumoral subsequente sem vazamento da ferida.
- Usando uma pinça, afaste o tecido adiposo da face e do subcutâneo entre o tumor e o peritônio. O tumor subcutâneo é normalmente aderido ao lado da pele.
- Abra a ferida segurando suavemente a pele no lado portador do tumor usando uma pinça e "inverta" o tumor para que fique visível do lado de fora (Figura 2C, 2D).
nota: A seção do tumor a ser reduzida deve estar mais próxima da abertura para ter pele suficiente para fechar a ferida. Tenha cuidado para não cortar a pele ao remover o tumor.
- Usando uma tesoura, corte a cápsula tumoral ao meio para removê-la, começando pela base do tumor mais próxima da abertura.
- Para cirurgia de redução de 50%, corte no meio do tumor. Com uma pinça curva, retire a seção do tumor a ser removida (50%); Recolha quaisquer restos da área debulked.
- Para redução de 75%, execute uma redução de 50% do tumor como na parte 2.3.5 acima. Em seguida, corte ao meio os 50% restantes do tumor e retire 25% do tumor usando uma pinça curva, conforme descrito acima.
- Fechando o local cirúrgico
- Coloque o tumor restante de volta sob a pele e, usando uma pinça, junte as abas da pele e alinhe a pele ao longo da ferida.
- Segure a pele unida a 5 mm da borda da ferida e use clipes cirúrgicos para fechar a ferida, começando pelo lado mais próximo da pinça. Aplique quantos clipes forem necessários para garantir que nenhum tecido subjacente seja exposto. Geralmente, três a quatro clipes são aplicados com folgas de 2 mm entre os clipes.
nota: Se algum clipe não estiver bem aplicado, remova-o usando um removedor de clipe e substitua-o por novos clipes.
- Recuperação de camundongos
- Permitir que os ratinhos recuperem, colocando-os na câmara de aquecimento quente (37 °C).
- Coloque a gaiola do mouse na almofada térmica. Monitore os ratos na câmara de aquecimento até que eles se recuperem do anestésico (acordados e andando) e, em seguida, coloque os ratos de volta na gaiola. Deixe a gaiola na almofada térmica por mais 10 minutos, até que os ratos se tornem mais ativos.
- Dê aos ratos comida úmida e macia. Monitore os camundongos 1 hora após a cirurgia para recuperação e certifique-se de que os clipes permaneçam no lugar. Certifique-se de que a gaiola esteja metade colocada/metade fora da almofada térmica para permitir que os animais autorregulem a temperatura enquanto estiverem desacompanhados.
- Dose aos camundongos com 0,1 mg / kg de buprenorfina (100 μL por via subcutânea na nuca) 6-8 horas após a cirurgia (no final do dia). Monitore os camundongos no início da manhã seguinte e administre novamente os camundongos com 0,1 mg / kg de buprenorfina (100 μL por via subcutânea na nuca). Dê mais comida úmida conforme necessário.
- Monitore os ratos diariamente pelos próximos sete dias. Os clipes podem ser removidos após sete dias usando o removedor de clipes.
- Tratamento adjuvante ou neoadjuvante
- Trate os camundongos no perioperatório com terapia (neo) adjuvante a qualquer momento, dependendo do tratamento de interesse.
- Por exemplo, trate camundongos com uma dose de 100 μg de anti-CTLA-4 por via intraperitoneal (i.p.) no dia 15 após a inoculação ou com três doses de 200 μg anti-PD-1 i.p. nos dias 15, 17 e 19 após a inoculação.
