Uma terapia adjuvante em um modelo de camundongo com um tumor subcutâneo ressecado incompletamente

Resumo

Fonte: Rwandamuriye, F. X. et al., Um modelo de camundongo de sarcoma de tecidos moles incompletamente ressecado para testar terapias (neo)adjuvantes.J. Vis. Exp.(2020)

Este vídeo ilustra o teste de terapia adjuvante ou adicional em um modelo de camundongo com tumores subcutâneos ressecados de forma incompleta. O camundongo parcialmente ressecado pelo tumor é tratado com um anticorpo direcionado à proteína anticitotóxica das células T reguladoras, reduzindo potencialmente o crescimento do tumor e sugerindo terapia adjuvante eficaz.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Inoculação de células

1. Preparação de células e animais
   1. Certifique-se de que a linhagem celular seja mantida no meio recomendado. Por exemplo, mantenha a linhagem celular WEHI 164 em meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 2 mM de L-glutamina, 10% de soro fetal bovino, 20 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES), 0,05 mM de 2-mercaptoetanol, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina.
      nota: Células de passagem pelo menos 3 e até 5 vezes após serem removidas do armazenamento criogênico. Para garantir a viabilidade celular ideal, as células devem ser divididas quando estiverem entre 70-80% confluentes. As linhagens celulares tumorais devem ser testadas para micoplasma, pois a infecção pode alterar o crescimento celular e influenciar a resposta imune in vivo.
   2. Um dia antes da inoculação, raspe os camundongos no flanco inferior direito usando uma tesoura.
      nota: Camundongos BALB/c fêmeas, com idade entre 8-12 semanas, com peso normal (16 -22 gramas) foram utilizados neste experimento.
   3. No dia da inoculação, colher células WEHI 164 quando 70-80% confluentes por tripsinização.
      1. Aspire o meio de cultura dos frascos de cultura de tecidos e, em seguida, adicione solução tamponada com fosfato estéril (1x PBS), para remover vestígios remanescentes de soro fetal bovino (FBS).
      2. Aspirar o PBS dos balões de cultura de tecidos. Adicione 3 ml de tripsina a 0,05% (para um balão T75) e, em seguida, agite o balão de modo a que toda a superfície do balão com células seja coberta por tripsina.
      3. Incubar o balão a 37 °C, incubadora de CO₂ a 5% durante 3 min. Verificar as células periodicamente, batendo nas laterais do balão para ver se as células se deslocaram.
      4. Remover frascos da incubadora de cultura de células e adicionar 5 mL de meio suplementado com FBS para neutralizar a tripsina.
         nota: Não deixe as células na tripsina por mais tempo do que o necessário, pois isso pode danificar as células e levar à baixa viabilidade celular.
      5. Suspensão de pipeta várias vezes para obter uma suspensão de célula única. Transfira a suspensão da célula para um tubo de centrífuga cônico.
      6. Células de pellets girando a 350 x g por 3 min.
   4. Lave as células três vezes em 1x PBS.
      1. Ressuspenda as células em 50 mL de PBS estéril 1x e lave as células pipetando a suspensão da célula para cima e para baixo. Células de pellets girando a 350 x g por 3 min.
      2. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 15 mL de PBS 1x estéril. Lave as células pipetando a suspensão da célula para cima e para baixo. Células de pellets girando a 350 x g por 3 min.
      3. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em exatamente 10 mL de PBS 1x estéril. Lave as células como na etapa 1.1.4.2 e transfira uma pequena quantidade (aproximadamente 100 μL) de suspensão de células para um tubo de centrífuga para contagem. Células de pellets girando a 350 x g por 3 min.
   5. Determine o número de células usando o método de exclusão Trypan blue usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado. Ressuspenda as células em PBS estéril 1x a uma concentração de 5 x 10⁶ células/mL. Mantenha a suspensão celular no gelo.
      nota: A viabilidade das células tumorais deve ser igual ou superior a 80% para garantir o crescimento tumoral reprodutível.
2. Inoculação subcutânea
   1. Misture bem a suspensão celular e encha uma seringa com uma agulha de 26 G com 100 μL de suspensão celular (5 x 10⁵ células) em 1x PBS estéril. Repita a mistura de células antes de carregar a próxima seringa.
      nota: Mantenha as células no gelo durante todo o procedimento para manter a viabilidade.
   2. Restrinja o mouse adequadamente, garantindo o acesso ao flanco inferior direito. Inocule o camundongo por via subcutânea no flanco inferior direito raspado.
      nota: Certifique-se de que a inoculação não esteja no peritônio levantando ligeiramente a agulha, que deve ser visível sob a pele. Um nódulo semelhante a uma bolha deve se formar sob a pele após a inoculação.
   3. Monitorizar os ratinhos conforme exigido pela aprovação ética aplicável e realizar a ressecção cirúrgica quando os tumores atingirem um tamanho de cerca de 50 mm².

2. Ressecção cirúrgica parcial do tumor

NOTA: Este protocolo requer DOIS pesquisadores; um para procedimentos cirúrgicos (CIRURGIÃO) e outro para monitoramento de camundongos (ASSISTENTE).

1. Configuração da cirurgia
   1. No dia 12 após a inoculação, quando os tumores atingirem um tamanho de aproximadamente 50 mm², administre camundongos com 100 μL (0,1 mg / kg) de buprenorfina s.c. na nuca, 30 minutos antes da cirurgia.
   2. Configure a área cirúrgica com uma almofada térmica coberta com um casaco de bancada e configure um cone nasal para anestesia. Esterilize as ferramentas cirúrgicas antes do uso e entre cada animal usando um esterilizador de esferas de calor, permitindo que as ferramentas esfriem antes do uso. Tenha os seguintes equipamentos cirúrgicos limpos e de fácil acesso: clorexidina, cotonete, gaze, gel para os olhos, duas pinças curvas, tesoura, aplicador de clipe, removedor de clipe e recargas de clipe (Figura 1A, 1B).
   3. Aqueça a câmara de aquecimento a 37 °C e coloque outra almofada térmica para recuperação (Figura 1C). Coloque as ferramentas esterilizadas em uma superfície estéril, como almofadas autoclavadas.
2. anestesia
   1. Coloque o camundongo na câmara de indução e anestesie o camundongo com isoflurano a 4% (4% em oxigênio a 100% a uma taxa de fluxo de 1 L / min) até que a taxa de respiração diminua para aproximadamente 60 respirações por minuto (1 por segundo) (isso geralmente leva <1 min).
      nota: Não deixe o rato na câmara por muito tempo, pois isso pode levar à asfixia e à morte. Tenha apenas um camundongo sob anestesia por vez.
   2. Transfira o mouse para a almofada de calor na mesa de cirurgia, coloque o mouse com o nariz no cone do nariz e mantenha o estado anestésico com isoflurano a 3-4% em oxigênio a 100% a uma taxa de fluxo de 0,5 L/min. Monitore a frequência respiratória para garantir que a profundidade da anestesia seja mantida.
      nota: O ASSISTENTE deve monitorar a respiração do camundongo durante toda a cirurgia para garantir que o nível correto de anestesia seja mantido. Diminua a concentração do anestésico se a respiração ficar muito lenta ou aumente a concentração se a profundidade da anestesia for muito rasa. Se o camundongo começar a ofegar, remova o camundongo do cone do nariz, diminua a concentração de anestésico e espere até que a respiração se normalize antes de colocá-lo no cone do nariz novamente.
   3. Realize um "teste de pinça" e um "teste de reflexo da córnea" para garantir que o camundongo esteja totalmente anestesiado antes de iniciar a cirurgia.
      nota: O movimento de qualquer parte do mouse é uma indicação de que o mouse não está totalmente anestesiado. O animal deve receber imediatamente anestésico adicional, aumentando a concentração do anestésico.
   4. Cubra os olhos do rato com uma pequena quantidade de gel oftálmico para evitar o ressecamento dos olhos.
3. Procedimento cirúrgico
   1. Esfregue a área cirúrgica 3 vezes com clorexidina alcoólica. Com uma pinça e uma tesoura, faça uma incisão reta de 1 cm ao longo do lado dorsal, a 3 mm de distância do tumor (Figura 2A, 2B).
      nota: Padronizar a incisão para 1 cm em cada camundongo (usando uma régua) permite uma avaliação uniforme da cicatrização de feridas entre camundongos. A localização da incisão a 3 mm de distância do tumor permite a terapia adjuvante intratumoral subsequente sem vazamento da ferida.
   2. Usando uma pinça, afaste o tecido adiposo da face e do subcutâneo entre o tumor e o peritônio. O tumor subcutâneo é normalmente aderido ao lado da pele.
   3. Abra a ferida segurando suavemente a pele no lado portador do tumor usando uma pinça e "inverta" o tumor para que fique visível do lado de fora (Figura 2C, 2D).
      nota: A seção do tumor a ser reduzida deve estar mais próxima da abertura para ter pele suficiente para fechar a ferida. Tenha cuidado para não cortar a pele ao remover o tumor.
   4. Usando uma tesoura, corte a cápsula tumoral ao meio para removê-la, começando pela base do tumor mais próxima da abertura.
   5. Para cirurgia de redução de 50%, corte no meio do tumor. Com uma pinça curva, retire a seção do tumor a ser removida (50%); Recolha quaisquer restos da área debulked.
   6. Para redução de 75%, execute uma redução de 50% do tumor como na parte 2.3.5 acima. Em seguida, corte ao meio os 50% restantes do tumor e retire 25% do tumor usando uma pinça curva, conforme descrito acima.
4. Fechando o local cirúrgico
   1. Coloque o tumor restante de volta sob a pele e, usando uma pinça, junte as abas da pele e alinhe a pele ao longo da ferida.
   2. Segure a pele unida a 5 mm da borda da ferida e use clipes cirúrgicos para fechar a ferida, começando pelo lado mais próximo da pinça. Aplique quantos clipes forem necessários para garantir que nenhum tecido subjacente seja exposto. Geralmente, três a quatro clipes são aplicados com folgas de 2 mm entre os clipes.
      nota: Se algum clipe não estiver bem aplicado, remova-o usando um removedor de clipe e substitua-o por novos clipes.
5. Recuperação de camundongos
   1. Permitir que os ratinhos recuperem, colocando-os na câmara de aquecimento quente (37 °C).
   2. Coloque a gaiola do mouse na almofada térmica. Monitore os ratos na câmara de aquecimento até que eles se recuperem do anestésico (acordados e andando) e, em seguida, coloque os ratos de volta na gaiola. Deixe a gaiola na almofada térmica por mais 10 minutos, até que os ratos se tornem mais ativos.
   3. Dê aos ratos comida úmida e macia. Monitore os camundongos 1 hora após a cirurgia para recuperação e certifique-se de que os clipes permaneçam no lugar. Certifique-se de que a gaiola esteja metade colocada/metade fora da almofada térmica para permitir que os animais autorregulem a temperatura enquanto estiverem desacompanhados.
   4. Dose aos camundongos com 0,1 mg / kg de buprenorfina (100 μL por via subcutânea na nuca) 6-8 horas após a cirurgia (no final do dia). Monitore os camundongos no início da manhã seguinte e administre novamente os camundongos com 0,1 mg / kg de buprenorfina (100 μL por via subcutânea na nuca). Dê mais comida úmida conforme necessário.
   5. Monitore os ratos diariamente pelos próximos sete dias. Os clipes podem ser removidos após sete dias usando o removedor de clipes.
6. Tratamento adjuvante ou neoadjuvante
   1. Trate os camundongos no perioperatório com terapia (neo) adjuvante a qualquer momento, dependendo do tratamento de interesse.
   2. Por exemplo, trate camundongos com uma dose de 100 μg de anti-CTLA-4 por via intraperitoneal (i.p.) no dia 15 após a inoculação ou com três doses de 200 μg anti-PD-1 i.p. nos dias 15, 17 e 19 após a inoculação.

Resultados

Figura 1: Imagens representativas do setup da cirurgia.(A) Uma imagem completa da configuração da cirurgia mostrando as ferramentas cirúrgicas (listadas na etapa 2.1) e a máquina anestésica. (B) Uma imagem instantânea da mesa cirúrgica mostrando todos os materiais de fácil acesso. (C) Uma câmara de aquecimento e uma almofada de aquecimento para recup...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa de insulina de calibre 26 0,5 mL	Becton Dickinson, Austrália	326769	nenhum
2-Mercaptoetanol	Life Technologies Austrália Pty Ltd	21985023	nenhum
Máquina de gás anestésico	Darvall Vet, Austrália	Referência: 2848	nenhum
Anti-CTLA-4	BioXcell, EUA	BE0164	nenhum
Anti-PD-1	BioXcell, EUA	BP0273	nenhum
Injeção de cloridrato de buprenorfina, 0,3 mg / mL	RB healthcare UK Limited, Reino Unido	Rolamento 55175	Pedido de prescrição
Esfoliante Cirúrgico de Clorexidina 4%	Perigo Austrália, Austrália	CHL01449F (esfregar	nenhum
Soro fetal bovino	CellSera, Austrália	AU-FBS-PG	nenhum
Fórceps Fino 10,5 cm	Casa cirúrgica, Austrália Ocidental	CC74110	nenhum
Pinça Fina 12 cm Serrilhada	Casa cirúrgica, Austrália Ocidental	CC74212	nenhum
Fórceps Halsted 14 cm	Casa cirúrgica, Austrália Ocidental	CD01114	nenhum
Câmara de aquecimento	Datesand Ltd, Reino Unido	Mini-Termacage	nenhum
HEPES (1M)	Life Technologies Austrália Pty Ltd	15630080	nenhum
Isoflurano	Henry Schein Saúde Animal, Austrália	Referência: 29405	Pedido de prescrição
Pomada lubrificante para os olhos	Alcon	n/a	nenhum
Penicilina/estreptomicina 1000X	Life Technologies Austrália Pty Ltd	15140122	nenhum
Solução tamponada com fosfato 10x	Life Technologies Austrália Pty Ltd	70013-032	nenhum
Clipes Reflex 7mm	Able scientific, Austrália	AS59038	nenhum
Aplicador de clipe de ferida Reflex 7mm	Able scientific, Austrália	AS59036	nenhum
Removedor de clipe de ferida reflexo	Able scientific, Austrália	AS59037	nenhum
Circuito respiratório de anestesia Qube para roedores	Darvall Vet, Austrália	#7885	nenhum
Instituto Memorial de Roswell Park (RPMI) 1640 Médio + L-glutamina	Life Technologies Austrália Pty Ltd	21870092	nenhum
Tesoura Iris STR 11 cm	Casa cirúrgica, Austrália Ocidental	KF3211	nenhum
Tesoura Iris STR 9 cm	Casa cirúrgica, Austrália Ocidental	JH4209	nenhum
Câmara de indução pequena	Darvall Vet, Austrália	Referência: 9630	nenhum
TrypLE expresso 1x	Life Technologies Austrália Pty Ltd	Rolamento 12604-021	nenhum