Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Processamento da amostra de pele humana do dador
NOTA: A amostra de pele humana usada neste transplante foi uma grande amostra coletada do abdômen de um paciente saudável. A amostra deve ter pelo menos 15 cm x 7,5 cm. As limitações de tamanho podem afetar o número de camundongos para os quais a pele está disponível e a escolha do tamanho do enxerto.
- Mantenha a amostra de pele em temperaturas frias (no gelo; 4 ° C) antes da preparação e enxertia. Mantenha a amostra úmida em um copo fechado de coleta de amostras com a gaze embebida em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
NOTA: Não é recomendado armazenar a amostra de pele a 4 °C por mais de 2 dias. No entanto, existem relatórios em que as amostras de pele são armazenadas por mais tempo.
cuidado: Trate todo o tecido humano com precauções padrão de risco biológico.
- Prepare-se para dermatosar a amostra de pele humana em um capuz esterilizado de cultura de tecidos de pressão negativa em uma placa de dissecção esterilizada.
- Coloque a amostra de pele, com a epiderme voltada para cima, na placa de dissecação. Limpe a epiderme com uma almofada de preparação de álcool estéril e depois com PBS.
- Prenda a borda mais próxima da pele no lugar com um pino em T de dissecação de 1,5 polegada (consulte a Tabela de Materiais).
- Dermátomo da amostra de pele com uma espessura de 400 μm, aplicando pressão constante enquanto corta para frente em um ângulo de 30 ° a 45 °. Siga todas as instruções e medidas de segurança específicas do instrumento (consulte a Tabela de Materiais).
NOTA: Para obter detalhes sobre a técnica do dermátomo, consulte um relatório publicado anteriormente.
- Prepare uma placa de Petri de 100 mm x 20 mm colocando uma gaze estéril embebida em PBS estéril no fundo da placa. Coloque a pele, com a epiderme voltada para cima, sobre a gaze úmida.
- Sele e cubra as bordas da placa com uma película de vedação semitransparente (consulte a Tabela de Materiais) para garantir que a amostra não esteja contaminada. Armazene a amostra a 4° C antes da enxertia.
2. Condicionamento e preparação pré-operatório
- Prepare os instrumentos estéreis e uma estação cirúrgica estéril para enxertia. Use toalhas de papel autoclavadas como superfícies estéreis para colocação de instrumentos e mouses.
NOTA: Os camundongos podem ser enxertados após o desmame, mas são preferencialmente enxertados entre 8 e 10 semanas de idade. Camundongos de ambos os sexos podem ser enxertados.
- Realize o preparo cirúrgico, como depilação, em uma área fisicamente separada da estação cirúrgica.
- Prepare o anti-GR1 (ver Tabela de Materiais) diluindo-o para 1 mg / mL em solução salina estéril. Dose a cada camundongo com 100 μg / 100 μL da solução anti-GR1 por via intraperitoneal após a indução da anestesia.
- Anestesiar os camundongos, um de cada vez, com isoflurano ou outros anestésicos aprovados institucionalmente.
NOTA: O isoflurano precisa ser administrado em uma concentração de 3% a 5% durante a indução. Quando o camundongo estiver imóvel, diminua a concentração de isoflurano para 1% a 3% para afetar a duração da cirurgia.
- Monitore o camundongo quanto à profundidade apropriada da anestesia, observando a frequência respiratória, a ausência de resposta ao beliscão do dedo do pé e a coloração rosada apropriada das orelhas e da boca.
cuidado: Use máquinas anestésicas apropriadas e métodos de limpeza e evite a exposição a vapores de isoflurano.
- Transfira o mouse para uma almofada de aquecimento ou outra fonte de calor (consulte a Tabela de Materiais).
- Administre a pomada oftálmica passando uma pequena gota de pomada no olho com o dedo enluvado.
- Administre os analgésicos Buprenorfina (0,08 mg/kg) e Carprofeno (5 mg/kg) (ver Tabela de Materiais) por via subcutânea, beliscando a pele e injetando em um ângulo paralelo ao corpo.
NOTA: Preparar a analgesia pré-tratamento seguindo os protocolos institucionais. Siga as diretrizes institucionais para a seleção e administração de analgésicos. O método de analgesia utilizado neste estudo está descrito na etapa 2.7 e na Figura 1.
- Administre o anti-GR1 (preparado na etapa 2.4) por via intraperitoneal, levantando levemente o camundongo pela cauda, expondo o abdômen e injetando em um ângulo de 30 ° usando uma seringa de insulina de 1 mL (12,7 mm).
- Use tesouras elétricas seguras para animais (consulte a Tabela de Materiais) para raspar as porções média e superior do lado dorsal do mouse.
- Limpe todo o cabelo e aplique uma quantidade generosa de pomada depilatória na pele raspada por 30 s a 1 min.
- Limpe completamente a pomada depilatória com uma toalha de papel e PBS.
3. Procedimento de transplante
- Transfira o mouse para um local cirúrgico secundário, longe da estação de depilação.
- Esterilize o local da cirurgia com o bastão de iodo em movimentos circulares, começando no meio e trabalhando em direção à borda da área depilada.
- Coloque um pedaço de filme plástico estéril sobre o mouse e corte uma janela no plástico um pouco maior que o tamanho da área a ser enxertada.
- Corte uma porção retangular de 10 mm x 10 mm da pele do doador para ser enxertada com um bisturi. Faça isso segurando firmemente a pele do doador no lugar com a parte de trás da pinça e cortando ao lado da pinça com o bisturi.
- Usando a tesoura cirúrgica, corte uma área retangular de pele de camundongo correspondente ao tamanho do pedaço de pele do doador, criando um leito de enxerto. Use uma pinça para puxar a pele para longe do corpo e corte a pele com a tesoura inclinada para longe do corpo para evitar cortar profundamente a face.
- Coloque o pedaço de pele do doador, com a epiderme voltada para cima, no leito de enxerto preparado.
- Usando a parte de trás da pinça, manipule a pele, deslizando para frente e para trás até que a pele do doador fique completamente plana contra o leito do enxerto.
- Adicione gotas de cola cirúrgica adesivo tecidual (consulte a Tabela de Materiais) onde a pele do doador encontra a pele do camundongo e segure a pele do camundongo e do doador junto com uma pinça por 1-2 s para que a cola adira aos tecidos. Sele completamente a borda do enxerto e deixe a cola secar completamente.
- Enfaixe os camundongos (Figura 2) seguindo as etapas abaixo.
- Corte um pedaço de gaze de vaselina (ver Tabela de Materiais) grande o suficiente para cobrir completamente a área do enxerto.
- Cubra o enxerto com a gaze de vaselina e pressione levemente a gaze contra a pele usando uma pinça.
- Corte uma tira de um curativo de filme transparente longitudinalmente para que a largura seja grande o suficiente para cobrir a ferida do rato.
- Pressione firmemente o curativo de filme transparente, com o lado adesivo voltado para baixo, sobre a gaze. Role rapidamente o mouse para envolver o curativo completamente ao redor do tronco, garantindo que ele se encaixe perfeitamente sem impedir a respiração e que todos os membros estejam livres para o movimento.
- Coloque o mouse em uma gaiola de recuperação e monitore-o até que esteja alerta e se movendo. Forneça uma fonte de calor em parte da gaiola por pelo menos 15 min após a recuperação.
NOTA: Espera-se que os animais se recuperem dentro de 1-5 minutos após serem colocados na gaiola de recuperação.
