Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto. Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Estabelecimento de modelo humano baseado em PBMC
- Mieloablação de camundongos NOD/SCID usando ciclofosfamida: determinação de doses ótimas
- Compre camundongos fêmeas diabéticas/imunodeficiência combinada grave (NOD/SCID) não obesos (6-8 semanas).
nota: Todos os camundongos envolvidos neste estudo eram fêmeas.
- Prepare ciclofosfamida (CP) em diferentes doses (50, 100 e 150 mg / kg) em solução salina. Preparar dissulfiram (DS) em Tween-80 a 0,8% em soro fisiológico a 125 mg/kg.
NOTA: Diferentes concentrações de CP foram preparadas para permitir a administração de volumes iguais de solução do medicamento a camundongos que receberam diferentes doses de CP.
- Trate os animais com PC (intraperitoneal, i.p.) e SD (peroral, p.o.) uma vez ao dia durante 2 dias. Administre DS (p.o.) 2 h após cada dose de CP.
NOTA: A DS diminui a urotoxicidade da PC em camundongos, e foi sugerido que a PC combinada com a SD tem neutropenia mais duradoura do que os animais tratados apenas com PC. O regime de dose de PC pode precisar ser pré-determinado antes dos estudos reais e foi encontrado para variar ligeiramente entre diferentes cepas de camundongos imunodeficientes.
- Colete amostras de sangue do seio venoso orbital e transfira para tubos revestidos com ácido etilenodiaminotetracético de potássio (EDTA-K) em gelo no dia 0 (1 h antes da 1ª dose), dia 2 (24 h após a2ª dose) e dia 4 (72 h após a2ª dose).
- Examine o efeito da mieloablação após o tratamento com CP e DS por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). Use CD11b anti-camundongo de rato (M1 / 70), Ly6C anti-camundongo de rato (HK1.4) e Ly6G anti-camundongo de rato (1A8) para controlar CD11b + Ly6Calto como neutrófilos, CD11b + Ly6Calto como monócitos.
- Registre o peso corporal e as condições de saúde dos camundongos diariamente durante uma semana. A dose ideal de CP e DS é determinada como o regime que resulta na depleção máxima de neutrófilos e monócitos sem causar toxicidade grave aos camundongos.
- Transplante humano de PBMC e enxerto tumoral: configuração do modelo
- Isolar PBMCs humanos de doadores saudáveis por centrifugação por gradiente de densidade de acordo com as instruções do fabricante.
- Pré-trate os camundongos com CP e DS conforme indicado nas etapas 1.1.2 e 1.1.3 para aumentar a eficiência do transplante.
- 20 a 24 h após a segunda dose de CP e DS, injetar linhagem de células tumorais humanas, como células A431 (ATCC, 2,5 x 106) e PBMCs isoladas 5 x 106 (misturadas em um total de 200 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 50% de Matrigel) ou fragmentos tumorais (3 x 3 x 3 mm3, em um volume total de 200 μL PBS contendo 50% de Matrigel) e 200 μL de 5 x 106 PBMCs (100 μL cada um para o lado esquerdo e direito do fragmento tumoral enxertado) por via subcutânea (s.c.) no flanco direito dos animais.
- Meça o volume do tumor primário e registre duas vezes por semana durante 4-6 semanas.
nota: Os camundongos serão sacrificados assim que seus pesos corporais perderem mais de 20% ou o volume do tumor atingir 2.000 mm3 ou o tumor estiver ulcerado.
- Eutanasiar os ratos em câmaras de gás com dióxido de carbono. Colete todos os tecidos tumorais em camundongos sacrificados com tesoura oftálmica e processe-os para análise histológica e imuno-histoquímica (IHC). Examine as expressões humanas de CD8, PD-1 e PD-L1 nesses tecidos.
