Inibição da autofagia baseada em siRNA em células dendríticas imaturas infectadas pelo vírus Herpes Simplex

Resumo

Fonte: Düthorn, A., et al. siRNA Eletroporação para modular a autofagia em células dendríticas derivadas de monócitos infectadas pelo vírus Herpes Simplex tipo 1. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra uma pequena técnica baseada em RNA interferente (siRNA) para interferir no fluxo autofágico. Um siRNA direcionado ao mRNA de FIP200 é introduzido em células dendríticas imaturas derivadas de monócitos (iDCs) usando eletroporação, causando o knockdown da expressão de FIP200 e levando à inibição da ruptura da lâmina nuclear por autofagia. Ao adicionar o vírus herpes simplex (HSV), a saída nuclear da progênie viral é inibida devido à ausência de ruptura da lâmina via fluxo autofágico.

Protocolo

DCs derivadas de monócitos foram geradas a partir de produtos de leucaférese de doadores saudáveis. Para isso, foi obtido um voto positivo do comitê de ética local (número de referência 4556). Os experimentos do presente estudo foram realizados de acordo com as recomendações do comitê de ética da "Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg" (número de referência 4556). Todos os doadores aprovaram um consentimento informado por escrito, incluindo a concordância com a Declaração de Helsinque.

1. Geração e manuseio de células dendríticas imaturas (iDCs) e células dendríticas maduras (mDCs)

1. Isolar as células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) das câmaras do sistema de leucorredução (LRSCs) conforme descrito anteriormente. Evite a criopreservação de PBMCs e use-as diretamente após o isolamento para obter maiores rendimentos de DC.
2. Gerar DCs humanas a partir de PBMCs de diferentes doadores saudáveis em frascos de cultura de células T175, conforme descrito anteriormente. Resumidamente, use 350-400 milhões de PBMCs em 30 mL de meio DC (RPMI 1640 sem L-glutamina, 1% (v / v) de soro humano tipo AB (soro AB), 100 U / mL de penicilina, 100 mg / mL de estreptomicina, 0,4 mM de L-glutamina, 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil) -1-piperazineetanossulfônico (HEPES)) por frasco de cultura de células para isolamento de monócitos por adesão. Após 1 h, lave a fração não aderente usando RPMI 1640. Adicione meio DC fresco suplementado com 800 U / mL de fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) e 250 U / mL de interleucina-4 (IL-4) e incube por 3 dias.
   1. No dia 3 após a adesão, adicione 5 mL de meio DC fresco contendo GM-CSF e IL-4 com uma concentração final de 400 U / mL e 250 U / mL por frasco de cultura de células, respectivamente, para diferenciação DC.
   2. Para colher iDCs, enxágue suavemente os iDCs frouxamente aderentes do fundo do frasco de cultura de células, no dia 4 após a adesão. Repita esta etapa 2 vezes. Para geração de mDCs, adicione coquetel de maturação composto da seguinte forma: GM-CSF (concentração final: 40 U/mL), IL-4 (concentração final: 250 U/mL), interleucina-6 (IL-6, concentração final: 1000 U/mL), Interleucina-1 beta (IL-1β, concentração final: 200 U/mL), Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α, concentração final: 10 ng/mL), prostaglandina E2 (PGE2; concentração final: 1 μg/mL).
   3. Seis dias após a adesão (dois dias após a indução da maturação usando um coquetel de citocinas), enxágue os mDCs do fundo do frasco de cultura de células. Repita essa etapa duas vezes.
      nota: DCs imaturas e maduras podem ser geradas sequencialmente a partir de doadores idênticos em 1 frasco de cultura de células. Para tal, i) separar o número adequado de iDC e ii) induzir a maturação das células remanescentes nos frascos utilizando o cocktail de citocinas enumerado no passo 1.2.2.
3. Transfira iDCs ou mDCs no respectivo meio de cultura celular para tubos de 50 mL. Colha as células por centrifugação a 300 x g por 5 min.
   1. Ressuspenda suavemente (= lave) DCs em 5-10 mL de RPMI 1640 por frasco de cultura de células. Combine as respectivas suspensões DC em um tubo.
   2. Defina o número da célula usando uma câmara de contagem ou um método alternativo. Evite alterações de temperatura ao manusear iDCs, para reduzir o risco de alterações fenotípicas.

2. Análises por citometria de fluxo para monitorizar o estado de maturação fenotípica

1. Transfira iDCs ou mDCs (0,5 x 10⁶) da etapa 1.3.1 para um tubo de 1,5 mL. Colha as células por centrifugação a 3390 x g por 1,5 min. Lave as células uma vez com tampão FACS (PBS suplementado com 2% de soro fetal de bezerro (FCS)).
2. Ressuspenda as células em 100 μL de solução de coloração de anticorpos (tampão FACS) contendo anticorpos específicos marcados com fluorocromo contra moléculas de superfície definidas.
   1. Use os seguintes anticorpos para verificar a pureza (CD3- isotiocianato de fluoresceína [FITC], CD14- ficoeritrina [PE]), bem como o status de maturação das DCs (CD80-PacBlue [Azul Pacífico]/-PE-cianina5 [Cy5], CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7).
   2. Preparar uma amostra não corada em 100 μL de tampão FACS como controlo.
   3. Pinte as células no gelo no escuro por 30 min.
3. Em seguida, lave as células duas vezes em 1 mL de tampão FACS e centrifugue a 3390 x g por 1,5 min.
4. Finalmente, ressuspenda as células em 200 μL de tampão FACS suplementado com paraformaldeído a 2% (PFA) e analise as células por citometria de fluxo. As células fixas podem ser armazenadas a 4° C no escuro por até 2 dias.

3. Interferência do fluxo autofágico induzido por HSV-1 via eletroporação de iDCs usando FIP200-siRNA

NOTA: O presente protocolo para eletroporação de siRNA foi modificado de Prechtel et al. (2007) e Gerer et al. (2017).

1. Transfira iDCs (12 x 10⁶) no dia 3,5 após a adesão para um tubo de 50 mL. Em seguida, centrifugue as células a 300 x g durante 5 min e elimine o sobrenadante. Paralelamente, realize a análise de citometria de fluxo para monitorar o status de maturação conforme descrito na etapa 2 (Use Life/Dead violet em vez de CD80-PacBlue).
2. Lave suavemente os iDCs em 5 mL de OptiMEM sem vermelho de fenol e centrifugue as células a 300 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda suavemente os iDCs em 200 μL de OptiMEM sem vermelho de fenol, ajustando uma concentração celular de 6 x 10⁶/100 μL. Não coloque as células no gelo e evite alterações de temperatura. Siga em frente rapidamente e evite longos períodos de incubação de iDCs em OptiMEM sem vermelho de fenol.
3. Transfira 75 pmol de siRNA específico para FIP200 ou 75 pmol de siRNA mexido, como controle, para eletrocubetas de 4 mm e adicione 100 μL (6x10⁶ células) da suspensão celular. Pulsar diretamente iDCs usando o aparelho de eletroporação I, aplicando as seguintes configurações: 500 V por 1 ms.
   1. Antes do procedimento experimental, preparar suspensões de siRNA de acordo com as instruções do fabricante, alíquota e armazená-las a -20 °C. Descongelar e mantê-las congeladas quando utilizarem estes siRNAs para electroporação. Antes de eletroporar as amostras, execute um pulso de teste.
4. Após a eletroporação, transfira diretamente o iDC para placas de 6 poços com meio DC fresco pré-aquecido (suplementado com 40 U / mL de GM-CSF e 250 U / mL de IL-4). Semeie as células a uma concentração final de 1 x 10⁶ / mL e coloque-as em uma incubadora. Não enxágue as células da eletrocubeta.
5. Após 48 h, examine primeiro a morfologia das iDCs eletroporadas microscopicamente. Em seguida, colha as células usando um raspador de células e transfira-as para tubos de 15 mL. Enxágue os poços com 1 mL de PBS suplementado com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,01% e transfira a solução nos respectivos tubos.
6. Posteriormente, divida 6 x 10⁶ iDCs por condição de siRNA, conforme descrito nas próximas etapas.
   1. Use 0,5 x 10⁶ células para avaliar o status de maturação e a viabilidade celular, conforme descrito na etapa 2. Use os seguintes anticorpos: CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, MHCII-APC-Cy7 e violeta Life/Dead.
   2. Use 1 x 10⁶ células para análises de Western blot para verificar a eficiência de knockdown específica do FIP200. Transfira e colha as células em um tubo safelock de 1,5 mL por centrifugação a 3390 x g por 1,5 min. Preparar lisados celulares e realizar análises de Western blot.
   3. Use as células restantes (4,5 x 10⁶) para experimentos de infecção por HSV-1. Para cada condição experimental, transfira 2,25 x 10⁶ iDCs para tubos de 2 mL e infecte-os com HSV1 em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 2 ou adicione tampão MNT como um controle simulado. Execute a infecção conforme descrito.
   4. Às 20 h após a infecção (hpi), colha as células usando um raspador de células e prepare lisados celulares para análises de Western blot.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Unidade central do nucleofector 4D (aparelho de eletroporação II)	Lonza (Basileia, Suíça)	AAF-1002B
AB-Soro	Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Alemanha)	H4522	Cultivo de células dendríticas
ACD-A	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Alemanha)	9007281
Amaxa P3 Célula Primária 4D-Nucleofector X Kit L (aparelho de kit de eletroporação II)	Lonza (Basileia, Suíça)	V4XP-3024
Reagente de detecção de blotting Amersham ECL Prime Western	GE Healthcare (Solingen, Alemanha)	RPN2232	Detecção de Western Blot
Persulfato de amônio (APS)	Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Alemanha)	Resposta 3678
IgG anti-camundongo (camundongo, policlonal, HRP)	Sinalização celular (Leiden, Holanda)	Nº 7076	Detecção de Western Blot
IgG anti-coelho (cabra, policlonal, HRP)	Sinalização celular (Leiden, Holanda)	Pedido 7074	Detecção de Western Blot
Citômetro de fluxo BD FACS Canto II	BD Biosciences (Heidelberg, Alemanha)	338962
Câmara de Mancha Fastblot B44	Biometra (Göttingen, Alemanha)	846-015-100
CCR7 (mouse, Pe-Cy7)	BioLegend (Fell, Alemanha)	557648	Citometria de fluxo Diluição: 1:100 Clone: G043H7
CD11c (camundongo, Pe-Cy5)	BD Biosciences (Heidelberg, Alemanha)	561692	Citometria de fluxo Diluição: 1:100 Clone: B-ly6
CD14 (camundongo, PE)	BD Biosciences (Heidelberg, Alemanha)	555398	Citometria de fluxo Diluição: 1:100 Clone: M5E2
CD3 (camundongo, FITC)	BD Biosciences (Heidelberg, Alemanha)	555332	Citometria de fluxo Diluição: 1:100 Clone: UCHT1
CD80 (mouse, V450)	BD Biosciences (Heidelberg, Alemanha)	560442	Citometria de fluxo Diluição: 1:100 Clone: L307.4
CD83 (camundongo, APC)	eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Alemanha)	17-0839-41	Citometria de fluxo Diluição: 1:200 Clone: HB15e
CD86 (camundongo, PE)	BD Biosciences (Heidelberg, Alemanha)	553692	Citometria de fluxo Diluição: 1:100
Imagem celular EVOS FL	Sistema AMG/Life Technologies (Carlsbad, EUA)	AMF4300
FIP200 (coelho)	Sinalização celular (Leiden, Holanda)	Rolamento 12436	Detecção de Western Blot Diluição: 1:1000 Clone: D10D11
Aparelho Gene Pulser II (aparelho de eletroporação I)	BioRad Laboratories GmbH (Munique, Alemanha)	Rolamento 165-2112
GM-CSF (4x104 U/mL)	Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemanha)	130-093-868
HLA-DR (mouse, APC-Cy7)	BioLegend (Fell, Alemanha)	307618	Citometria de fluxo Diluição: 1:200 Clone: L243
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43	BioVex		Infecção DC
IL-1β (0,1x106 U/mL)	Cell Genix GmbH (Freiburg, Alemanha)	1411-050
IL-4 (1x106 U/mL)	Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemanha)	130-093-924
IL-6 (1x106 U/mL)	Cell Genix GmbH (Freiburg, Alemanha)	1404-050
ImageQuant LAS 4000	GE Healthcare (Solingen, Alemanha)	28955810
L-glutamina	Lonza (Basileia, Suíça)	17-605E
Kit de coloração de células mortas violeta corrigível LIVE/DEAD	Life Technologies (Carlsbad, CA, EUA)	L34964	Coloração L/D em citometria de fluxo
Linfoprep	Alere Technologies AS (Oslo, Noruega)	04-03-9391/01
Cloreto de magnésio	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Alemanha)	Rolamento A537.1
Megafuga 2.0 RS	Heraeus (Hanau, Alemanha)	75015505
Câmara de contagem de Neubauer	Brand (Wertheim, Alemanha)	717805
Frascos de cultura de células Nunc (175,0 cm2)	Thermo Scientific (Rockford, EUA)	Rolamento 159910
Paraformaldeído, 16 %	Alfa Aesar, Haverhill, EUA	43368.9 milhões
PerfectSpin 24 Plus	Peqlab (Erlangen, Alemanha)	C2500-R-PL
PGE2 (1 mg/mL)	Pfizer (Berlim, Alemanha)	BE130681
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Lonza (Basileia, Suíça)	17-512F
RestoreTM Western Blot Stripping Buffer	Thermo Scientific, Rockford, EUA	21059
Plataforma de balanço wt 15	Biometra (Göttingen, Alemanha)	Telefone: 042-590
RotiBlock	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Alemanha)	A151.4
Roti-Carga 1 (4x)	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Alemanha)	K929.3
Gel Rotifóforo 30 (37,5:1)	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Alemanha)	3029.1
RPMI 1640	Lonza (Basileia, Suíça)	12-167F
Dodecil sulfato de sódio (SDS)	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Alemanha)	2326,2
Conforto do Thermomixer	Eppendorf (Hamburgo, Alemanha)	Rolamento 5355 000.011
TNF-α (10 μg/mL)	Peprotech (Hamburgo, Alemanha)	300-01A
Tris	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Alemanha)	Rolamento 4855.3
Solução de azul de tripano (0,4 %)	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Alemanha)	T8154
Pré-adolescente 20	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Alemanha)	9127.1
Membrana de nitrocelulose Whatman 0,2 μm	GE Healthcare (Solingen, Alemanha)	10600001
Papel para Cromatografia WhatmanTM 3 mm Chr	Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Alemanha)	3030917