Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Animais
- Cultive camundongos fêmeas C57BL6 / J até 8 semanas de idade em gaiolas ventiladas individualmente com filtros de microisolamento.
NOTA: As mulheres são preferidas porque a conformação anatômica de seu aparelho urogenital externo torna o cateterismo mais fácil do que nos homens.
2. Cultura de células
- Manter a linha celular de carcinoma urotelial de camundongo MB49 em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado por calor e 50 μg / ml de gentamicina a 37 ° C em dióxido de carbono a 5% umidificado (CO2).
- Cultive células MB49 em frascos T-75 até 80% de confluência. Tripsinizar e ressuspender a 0,5 × 105 - 0,5 × 106 células por 150 μl de solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes da implantação em camundongos.
3. Implante tumoral intravesical
- Anestesiar camundongos usando uma mistura dos anestésicos zoletil e xilor (33 mg / kg e 20 mg / kg, respectivamente), injetados por via intraperitoneal.
- Coloque os animais em decúbito dorsal e fixe as patas traseiras na almofada com fita adesiva. As patas devem estar suficientemente separadas para tornar o meato uretral bem visível e facilmente acessível para a inserção do cateter.
- NOTA: Para cateterismo, um cateter venoso pediátrico de 24 G é adequado para camundongos de 8 a 10 semanas de idade. A escolha do cateter é fundamental para evitar vazamento de líquido entre a parede uretral e o cateter. Cateteres de calibre maior devem ser usados para camundongos maiores ou mais velhos.
- Usando uma pinça pequena, aperte uma borda da parte externa da uretra e torça-a suavemente em direção à "extremidade da cabeça" dos camundongos. Essa ação expõe o meato uretral.
- Remova a agulha interna do cateter e insira-o na uretra em um ângulo de 45°, ligeiramente orientado para a "extremidade da cauda" dos camundongos. Não force a entrada do cateter; Em caso de resistência, basta torcer o cateter com muita suavidade até que ele deslize para dentro da uretra. Quando cerca de 0,5-0,8 cm do cateter estiver na uretra, coloque cuidadosamente o cateter paralelo à cauda dos camundongos e insira-o completamente.
- Usando uma seringa de 1 ml, cuja agulha deve ser inserida no cateter, lave a bexiga da urina residual injetando 200-300 μl de PBS estéril e aspire todo o líquido da bexiga.
- NOTA: Ao injetar PBS, a bexiga se encherá e o inchaço será visível entre as patas traseiras dos camundongos; isso confirma que o cateterismo está correto. A maioria dos cateteres tem um volume morto que deve ser considerado ao calcular o volume de injeção.
- Usando uma seringa estéril de 1 ml, injete 200 μl de ácido clorídrico (HCl) 0,1 N. Encha a bexiga para queimar toda a parede. Após 10 segundos, remova todo o ácido e neutralize imediatamente injetando 200 μl de hidróxido de sódio (NaOH) 0,1 N com uma seringa estéril. No caso de injecção do maior número de células (0,5 × 106), não é necessária a etapa de acidificação.
- Aspirar todo o líquido residual e lavar imediatamente a cavidade com 300 μl de PBS estéril.
- Esvazie a bexiga por aspiração e injete 150 μl de PBS contendo células MB49 (intervalo de 0,5 × 105 - 0,5 × 106) na bexiga. Deixe a seringa montada no cateter para evitar o vazamento de células. É melhor prender a seringa fixando-a na almofada com fita adesiva.
- Após 1 hora, extraia suavemente o cateter da uretra e coloque os camundongos na gaiola sob uma lâmpada incandescente até que acordem: isso geralmente ocorre entre 1 e 2 horas após o término do tratamento.
4. Entrega intravesical da proteína ativadora de neutrófilos Helicobacter pylori (HP-NAP)
- NOTA: Pelo menos 3 dias após a instilação celular, é possível iniciar o tratamento.
- Cateterize conforme descrito nas etapas 3.1 a 3.4. Nesta fase, não é necessário queimar a parede da bexiga com HCl.
- Usando uma seringa de 1 ml, lave a bexiga da urina residual injetando 200-300 μl de PBS estéril e aspire todo o líquido da bexiga.
- Injete 50 μg de HP-NAP por 150 μl de PBS na bexiga. Deixe a seringa presa ao cateter para evitar vazamento da solução proteica. Prenda a seringa fixando-a à almofada com fita adesiva.
- Após 1 hora, extraia suavemente o cateter da uretra e coloque os camundongos na gaiola sob uma lâmpada incandescente até que acordem.
