Suprimindo a replicação do vírus da hepatite B usando células T específicas do antígeno viral

Abstract

Fonte: Xiong, X., et al. Linfócitos T virais específicos de Ag derivados de células-tronco suprimem a replicação do HBV em camundongos. J. Vis. Exp. (2019).

O vídeo demonstra um ensaio usando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC) Essas células T, projetadas com receptores específicos do HBV, são transferidas para camundongos transgênicos. Os plasmídeos do genoma do HBV competentes para replicação são então injetados diretamente no fígado, permitindo a captação do DNA viral. Uma vez que os antígenos virais são expressos e apresentados por moléculas híbridas de MHC-I, as células T modificadas reconhecem e se ligam a esses complexos. Isso desencadeia a liberação de moléculas citotóxicas, resultando na destruição de células hepáticas infectadas pelo HBV e supressão da replicação viral.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo local
comitê institucional de cuidados com animais e o conselho de revisão veterinária JoVE. Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Geração de células T CD8⁺ específicas para Ag a partir de iPSCs (células T iPSC-CD8⁺)

1. Criação dos construtos retrovirais
   nota: Os genes α e β do receptor de células T (TCR) estão ligados à sequência de autoclivagem 2A. O vetor retroviral MSCV-IRES-DsRed (MiDR) é DsRed+.
   1. Subclone HBs183-191 (FLLTRILTI) específico de HBs183-191 (FLLTRILTI) genes TCR híbrido humano-murino restrito (s183 TCR) (Vα34 e Vβ28) no MiDR para criar a construção s183 MiDR (Figura 1A).
2. Transdução retroviral
   NOTA: As células Platinum-E (Plat-E) são usadas para empacotar retrovírus (carregando genes s183 TCR), que serão usados para transdução retroviral. As células Plat-E são células de empacotamento de retrovírus eficazes subjacentes às células 293T, que foram desenvolvidas por meio de construções de empacotamento exclusivas por meio do promotor EF1α para expressar a proteína de estrutura retroviral, incluindo gag, pol e env ecotrópico.
   1. Em uma placa de cultura de 100 mm, semeie 3 x 10⁶ células Plat-E em 8 mL de meio de cultura DMEM contendo 10% de soro fetal de bezerro (FCS) em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO₂, 1 dia antes da transfecção.
   2. No dia 0, transfecte a construção s183 MiDR nas células Plat-E usando um reagente de transfecção de DNA.
   3. No dia 1, semeie 1 x 10⁶ iPSCs (proteína fluorescente verde [GFP]+) em uma placa de cultura pré-revestida com gelatina.
   4. Nos dias 2–3, colete sobrenadante contendo retrovírus da cultura de células Plat-E para transduzir iPSCs com o s183 TCR na presença de solução de 1,6-dibromohexano.
   5. No dia 4, tripsinize as iPSCs transduzidas pelo gene s183 TCR, centrifugue a 400 x g por 5 min e semeie 3 × 10⁵ iPSCs em uma placa de cultura de 100 mm pré-revestida com 3 x 10⁶ células alimentadoras SNL76 / 7 irradiadas (irSNL76 / 7).
   6. No dia 5 ou 6 de confluência, tripsinizar as células, centrifugar a 400 x g por 5 min e processar para a classificação das células. Gating em células vivas, classifique as células duplamente positivas GFP e DsRED (as iPSCs transduzidas pelo gene s183 TCR) usando um classificador de células de alta velocidade. Semelhante à etapa 1.2.5, co-cultive as células classificadas em células alimentadoras irSNL76 / 7 para uso futuro.
3. Diferenciação de células T iPSC-CD8+ específicas para HBV
   NOTA: As células estromais OP9-DL1 / DL4 superexpressam os ligantes Notch DL1 e DL4, e a co-cultura de iPSCs com as iPSCs pode promover a diferenciação de células T mediada por sinalização Notch.
   1. Cultive iPSCs transduzidas pelo gene s183 TCR (s183 / iPSCs) na monocamada de células OP9-DL1-DL4 em meio α de meio essencial mínimo (MEM) contendo 20% de soro fetal bovino (FBS). Inclua o ligante tirosina quinase 3 (Flt3) semelhante à FMS murina (mFlt-3L; concentração final = 5 ng/mL) na cultura.
   2. No dia 0, semeie 0,5–1,0 x 10⁵ S183/iPSCs em uma placa de cultura de 10 cm previamente cultivada com células OP9-DL1-DL4. Valide se as células OP9-DL1-DL4 estão em uma condição de 80% a 90% de confluência.
   3. No dia 5, enxágue as iPSCs com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS), aspire a PBS, adicione a 4 mL de tripsina a 0,25% e incube em uma incubadora a 37 ° C por 10 min. Em seguida, adicione 8 mL suplementares de meio iPSC para interromper a digestão da tripsina. Acumule todas as soluções digestivas contendo as células e centrifugue a 400 x g por 5 min a 15–30 °C.
   4. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 10 mL de meio iPSC. Transferir a suspensão celular para uma nova placa de Petri de 10 cm e incubar numa incubadora durante 30 min a 37 °C.
   5. Após 30 minutos, colete a mídia iPSC contendo as células flutuantes. Passe a suspensão celular por um filtro de células de 70 μm e calcule o número de células.
   6. Semeie 5 x 10⁵ células na placa de cultura previamente cultivadas células OP9-DL1-DL4 com uma condição de 80% a 90% confluente, conforme descrito na etapa 1.3.1.
      nota: Para a diferenciação de células T, a cada 2-3 dias, as células derivadas de iPSC precisam ser re-semeadas com uma nova camada de células OP9-DL1-DL4.
4. avaliação
   1. Mudanças morfológicas de iPSCs diferenciadoras
      1. Observe as células ao microscópio em vários dias.
         nota: No dia 5, as colônias têm características semelhantes às do mesoderma, exibindo uma morfologia clássica em forma de fuso semelhante aos fibroblastos dérmicos humanos e crescimento sustentado in vitro. No dia 8, pequenos aglomerados redondos de células começam a aparecer.
   2. Análise de iPSCs diferenciadoras por citometria de fluxo
      1. Em vários dias de co-cultura, analise as células derivadas de iPSC conforme descrito anteriormente (Figura 1B, C).
   3. Análise funcional de iPSCs diferenciadoras
      1. No dia 28 de co-cultura, colete células T iPSC-CD8 + de culturas colhendo as células flutuantes, tripsinize as células restantes com 0,25% de tripsina, ressuspenda em 8 mL de meio iPSC, centrifugue por 5 min a 400 x g a 15–30 ° C, remova o meio e, em seguida, ressuspenda as células em 10 mL de meio.
      2. Manter as células ressuspensas numa cápsula fresca de 10 cm numa incubadora a 37 °C durante 30 min e montar as células flutuantes. Em seguida, enxágue as células uma vez com um PBS frio.
      3. Incubar esplenócitos depletados de células T 3 x 10⁶ (^CD4-CD8-) de baços de camundongos H-2 classe I, HLA-A2.1-transgênicos (HHD) com peptídeo s183 de 5 μM (FLLTRILTI) em 200 μL de meio a 4 ° C por 30 min.
      4. Produza uma mistura de células T iPSC-CD8⁺ com esplenócitos pulsados com peptídeo s183 (células T: esplenócitos = 1:4; use 0,75 x 10⁶ células T). Incubar a mistura de células a 37 °C numa incubadora de CO₂ durante 40 h. Durante as últimas 7 h, adicione 4 μL de brefeldina A diluída na cultura (concentração final de 1.000x, que será diluída em 1x meio de cultura) para bloquear os processos de transporte durante a ativação celular.
      5. Corar as células e realizar a análise citométrica de fluxo do interferon-gama intracelular (IFN-γ) conforme descrito anteriormente (Figura 2).

2. Indução da replicação do HBV através da entrega hidrodinâmica do plasmídeo do HBV

NOTA: A construção pAAV/HBV1.2 foi gerada conforme descrito anteriormente. O DNA completo do HBV 1.2 é incorporado ao vetor pAAV.

1. Entregas hidrodinâmicas de plasmídeo HBV através da veia da cauda
   1. Aqueça os camundongos HHD usando uma lâmpada de calor por 5 min na gaiola para dilatar a veia da cauda.
   2. Detenha o animal por meio de um limitador e limpe as caudas dos ratos com spray de etanol a 70%.
   3. Entrega de plasmídeo no fígado.
   4. Meça o peso corporal do mouse usando uma balança de medição.
   5. Diluir 10 μg de plasmídeo HBV no equivalente a 8% da massa corporal PBS (por exemplo, 1,6 mL para um camundongo de 20 g). Carregue o plasmídeo diluído em uma seringa de 3 mL com uma agulha hipodérmica de 26 G × 1⁄2" (0,45 × 12 mm).
   6. Localize uma das duas veias laterais da cauda no terço médio da cauda e posicione a agulha em qualquer uma das veias laterais. Administre a injeção contendo plasmídeo HBV através da veia da cauda dentro de 3 a 5 s.
2. Quantificação da viremia a partir do soro sanguíneo de camundongos infectados
   nota: A replicação do VHB ocorre do dia 3 ao 35 no soro do camundongo. A replicação do DNA atinge o pico no dia 7 e diminui gradualmente. O DNA do HBV não é eliminado do soro até o dia 35.
   1. Coleta de soro sanguíneo de camundongos infectados
      1. Colete aproximadamente 0,1 mL de sangue em um tubo de microcentrífuga de cada camundongo 3, 5, 7 e 10 dias após a infecção por sangramento retroorbital em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e, em seguida, incube em temperatura ambiente (RT) por 20 min.
      2. Centrifugar a amostra a 6.000 x g durante 15 min a 4 °C e recolher o sobrenadante de soro após centrifugação.
   2. Purifique o DNA do soro sanguíneo usando um kit de extração de DNA disponível comercialmente seguindo as recomendações do fabricante. Resumidamente, lise as células em uma coluna à base de sílica, faça as lavagens e extraia o DNA adicionando etanol 100% à coluna de eluição e centrifugando a 6000 x g por 1 min. Eluir o ADN em 50 μL de água isenta de RNase.
   3. Use 100 ng de DNA do HBV da eluição para análise de PCR em tempo real. Use os seguintes primers e sondas: forward 5' TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG 3'; reverso 5' GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3'; sonda 5' TCACCTCTGCCTAATC 3'.
      1. Use o genoma do HBV contendo plasmídeo (pAAV/HBV1.2) para a curva padrão e execute PCR em tempo real em um volume total de 10 μL (Figura 3).
   4. Configure a reação de PCR em um volume total de 10 μL, conforme mostrado na Tabela 1.
   5. Configure o programa de PCR no termociclador, conforme mostrado na Tabela 2. A taxa de transição de temperatura programada é de 20 °C/s para desnaturação/recozimento e 5 °C/s para extensão. Meça a fluorescência no final da fase de recozimento para cada ciclo para monitoramento de PCR em tempo real.

3. Redução da replicação do HBV por ACT de células T iPSC-CD8+ virais específicas para Ag

1. Transferência de células adotivas (ACT)
   1. Diferencie s183/iPSCs (1.3.7) nas células estromais OP9-DL1-DL4 na presença de mFlt-3L e mIL-7 por 8 dias, conforme descrito na seção 1.3.
   2. No dia 22, colete células T iPSC-CD8+ da placa de 10 cm com tripsina, depois lave e ressuspenda cada placa de 10 cm em 10 mL de meio fresco. Adicione as células a uma placa nova de 10 cm e retorne à incubadora por 30 min, como feito na seção 1.3. Após 30 min, colete células flutuantes.
   3. Use um filtro de náilon de 70 μm para passar as células para eliminar aglomerados de células e contar o número de células. Adapte as células a uma concentração de 1,5 x 10⁷ células/mL em solução fria de PBS e use um filtro de náilon de 70 μm para passar as células para eliminar os aglomerados de células novamente, se necessário. Mantenha as células no gelo até o ACT.
   4. Injete 200 μL de suspensão de células (3 x 10,⁶ células) em camundongos HHD de 4 a 6 semanas de idade através da veia da cauda.
2. Indução da replicação do HBV
   1. No dia 14 após a transferência celular, efectue a entrega hidrodinâmica do plasmídeo VHB através da veia da cauda, conforme descrito na secção 2.1.

Tabela 1: Volume de reação de PCR

Modelo de DNA	2 ml
Mistura de hibridização mestre de DNA ((Taq DNA polimerase, tampão de reação de PCR, 10 mM MgCl2 e mistura dNTP)	1 ml
25 mM MgCl2	0,8 ml
0,3 μM da sonda	3 ml
5 μM de cada primer	3,2 ml
total	10 ml

Tabela 2: Programa de PCR

desnaturação	Temperatura 95 °C	Horário 5 segundos
recozimento	53 °C	10 s
extensão	72 °C	20 s
	5 °C

Results

Figura 1: Geração de células T iPSC-CD8⁺ específicas para o vírus HBV Ag.

As iPSCs de camundongo são transduzidas com as seguintes construções retrovirais: HBs183-91 TCR (MiDR-s183 TCR) ou OVA257–264 TCR (MiDR-OVA TCR), e as iPSCs transduzidas são co-cultivadas com células estromais OP9-DL1/DL4 para diferenciação da linhagem T. (A) Representação esquemática do c...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camundongos HHD	Institut Pasteur, Paris, França		Camundongos H-2 classe I, HLA-A2.1-transgênicos (HHD)
iPS-MEF-Ng-20D-17	Banco de células RIKEN	APS0001
SNL76/7	ATCC	SCRC-1049
OP9	ATCC	CRL-2749
plasmídeo pAAV/HBV1.2	Dr. Dr. Pei-Jer Chen (Hospital Universitário Nacional de Taiwan, Taiwan)		Construção do DNA do VHB
Genes TCR específicos de HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)	Dr. Adam J Gehring (Instituto de Pesquisa do Hospital Geral de Toronto, Toronto, Canadá)		Genes TCR híbridos humano-murinos restritos a A2 específicos de FLLTRILTI (Vα34 e Vβ28)
Genes TCR específicos do OVA257–264	Dr. Dario A. Vignali (Universidade de Pittsburgh, PA)		Genes TCR restritos a H-2Kb específicos do SIINFEKL
Anticorpo anti-CD3 (17A2)	Biolenda	100236
Anticorpo anti-CD44 (IM7)	BD Pharmingen	103012
Anticorpo anti-CD4 (GK1.5)	Biolenda	100408
Anticorpo anti-CD8 (53-6.7)	Biolenda	100732
Anticorpo anti-IFN-γ (XMG1.2)	Biolenda	Rolamento 505810
Anticorpo anti-TNF-a (MP6-XT22)	Biolenda	506306
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
Anticorpo anti-HBs	Thermo Fisher	MA5-13059
Buffer de lise ACK	Lonza	10-548E
Brefeldin A	sigma	B7651
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
FBS	Hyclone	SH3007.01
Classificador de células FACSAria Fusion	Bd	Nº 656700
gelatina	MilliporeSigma	G9391
GeneJammer	Agilent	204130
Pentâmero HLA-A201-HBs183-91-PE	Pró-imune	F027-4A - 27
Anticorpo secundário anti-camundongo HRP	Invitrogen	Rolamento A27025
mFlt-3L	Peprotech	250-31L
mIL-7	Peprotech	217-17
Nuclease S7	Roche	10107921001
Paraformaldeído	MilliporeSigma	Rolamento P6148-500G	Cuidado: Alergênico, Carcenogênico, Tóxico
Tampão de permeabilização	Biolenda	421002
Polibreno	MilliporeSigma	107689
ProLong™ Gold Antifade Mountant com DAPI	Invitrogen	Pág. 36931
Kit de rotação de vírus QIAamp MinElute	Qiagen	Rolamento 57704