Suprimindo a replicação do vírus da hepatite B usando células T específicas do antígeno viral

Abstract

Fonte: Xiong, X., et al. Linfócitos T virais específicos de Ag derivados de células-tronco suprimem a replicação do HBV em camundongos. J. Vis. Exp. (2019).

O vídeo demonstra um ensaio usando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC) Essas células T, projetadas com receptores específicos do HBV, são transferidas para camundongos transgênicos. Os plasmídeos do genoma do HBV competentes para replicação são então injetados diretamente no fígado, permitindo a captação do DNA viral. Uma vez que os antígenos virais são expressos e apresentados por moléculas híbridas de MHC-I, as células T modificadas reconhecem e se ligam a esses complexos. Isso desencadeia a liberação de moléculas citotóxicas, resultando na destruição de células hepáticas infectadas pelo HBV e supressão da replicação viral.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo local
comitê institucional de cuidados com animais e o conselho de revisão veterinária JoVE. Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Geração de células T CD8⁺ específicas para Ag a partir de iPSCs (células T iPSC-CD8⁺)

1. Criação dos construtos retrovirais
   nota: Os genes α e β do receptor de células T (TCR) estão ligados à sequência de autoclivagem 2A. O vetor retroviral MSCV-IRES-DsRed (MiDR) é DsRed+.
   ....

Results

Figura 1: Geração de células T iPSC-CD8⁺ específicas para o vírus HBV Ag.

As iPSCs de camundongo são transduzidas com as seguintes construções retrovirais: HBs183-91 TCR (MiDR-s183 TCR) ou OVA257–264 TCR (MiDR-OVA TCR), e as iPSCs transduzidas são co-cultivadas com células estromais OP9-DL1/DL4 para diferenciação da linhagem T. (A) Representação esquemática do c.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camundongos HHD	Institut Pasteur, Paris, França		Camundongos H-2 classe I, HLA-A2.1-transgênicos (HHD)
iPS-MEF-Ng-20D-17	Banco de células RIKEN	APS0001
SNL76/7	ATCC	SCRC-1049
OP9	ATCC	CRL-2749
plasmídeo pAAV/HBV1.2	Dr. Dr. Pei-Jer Chen (Hospital Universitário Nacional de Taiwan, Taiwan)		Construção do DNA do VHB
Genes TCR específicos de HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)	Dr. Adam J Gehring (Instituto de Pesquisa do Hospital Geral de Toronto, Toronto, Canadá)		Genes TCR híbridos humano-murinos restritos a A2 específicos de FLLTRILTI (Vα34 e Vβ28)
Genes TCR específicos do OVA257–264	Dr. Dario A. Vignali (Universidade de Pittsburgh, PA)		Genes TCR restritos a H-2Kb específicos do SIINFEKL
Anticorpo anti-CD3 (17A2)	Biolenda	100236
Anticorpo anti-CD44 (IM7)	BD Pharmingen	103012
Anticorpo anti-CD4 (GK1.5)	Biolenda	100408
Anticorpo anti-CD8 (53-6.7)	Biolenda	100732
Anticorpo anti-IFN-γ (XMG1.2)	Biolenda	Rolamento 505810
Anticorpo anti-TNF-a (MP6-XT22)	Biolenda	506306
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
Anticorpo anti-HBs	Thermo Fisher	MA5-13059
Buffer de lise ACK	Lonza	10-548E
Brefeldin A	sigma	B7651
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
FBS	Hyclone	SH3007.01
Classificador de células FACSAria Fusion	Bd	Nº 656700
gelatina	MilliporeSigma	G9391
GeneJammer	Agilent	204130
Pentâmero HLA-A201-HBs183-91-PE	Pró-imune	F027-4A - 27
Anticorpo secundário anti-camundongo HRP	Invitrogen	Rolamento A27025
mFlt-3L	Peprotech	250-31L
mIL-7	Peprotech	217-17
Nuclease S7	Roche	10107921001
Paraformaldeído	MilliporeSigma	Rolamento P6148-500G	Cuidado: Alergênico, Carcenogênico, Tóxico
Tampão de permeabilização	Biolenda	421002
Polibreno	MilliporeSigma	107689
ProLong™ Gold Antifade Mountant com DAPI	Invitrogen	Pág. 36931
Kit de rotação de vírus QIAamp MinElute	Qiagen	Rolamento 57704