Uma terapia baseada em células para artrite autoimune em um modelo murino

Resumo

Fonte: Haque, M. et al., Desenvolvimento de células-troncoJ. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo mostra uma terapia baseada em células para artrite autoimune em camundongos. As células T reguladoras derivadas de iPSC que expressam receptores específicos de ovalbumina são injetadas com albumina de soro bovino metilado (mBSA) emulsionada em um adjuvante. As células apresentadoras de antígenos murinos (APCs) processam e apresentam o mBSA às células T, estimulando a ativação e migração das células T para a membrana sinovial da articulação do joelho. As injeções subsequentes envolvem mBSA sozinho no joelho esquerdo e uma combinação de mBSA e ovalbumina no joelho direito. No joelho esquerdo, a resposta imune ao mBSA desencadeia artrite, enquanto no joelho direito, as células T reguladoras que interagem com a ovalbumina atenuam a inflamação, melhorando os sintomas da artrite.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Maturação in vivo e supressão da artrite autoimune

1. Gere as construções a serem usadas na transdução retroviral subclonando os genes do receptor de células T OT-II (TCR) e a proteína forkhead box 3 (FoxP3) no plasmídeo MiDR ligado ao peptídeo autoclivado 2A para fazer a construção MiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3.
2. Realizar a transdução retroviral de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando células Plat E como linha celular de empacotamento.
3. Diferenciação in vivo e indução de artrite em camundongos.
   1. Diferencie iPSCs transduzidas por OT-II TCR/FoxP3 (OT-II-FoxP3/iPSCs), iPSCs transduzidas por FoxP3 e iPSCs transduzidas por DsRed nas células estromais OP9-DL1-DL4-I-A^b na presença das citocinas mFlt-3L e mIL-7 por 8 dias.
   2. No dia 0, semeie células B OP9-DL1-DL4-I-A com uma densidade mínima de 10⁴ células/^cm2 usando meio OP-9 (meio α-MEM contendo 20% de soro fetal de bezerro (FCS) e 2,2 g/L de bicarbonato de sódio. Placa 1 x 10⁶ células por prato de 10 cm.
   3. No dia 3, quando as células OP9-DL1-DL4-I-A^b se tornarem 80-90% confluentes, remova o meio e semeie 0,5 - 1 x 10⁵ iPSCs sobre as células OP9-DL1-DL4--I-A^b em meios OP-9.
      NOTA: Isso estabelece a co-cultura de iPSCs em células OP9-DL1-DL4-I-A^b e é considerado dia 0 de diferenciação.
   4. No dia 5, remova a mídia do prato de 10 cm por aspiração, lave as células com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) e aspire o PBS. Adicione 4 ml de tripsina a 0,25% e incube a 37 °C por 10 min. Adicione mais 8 ml de meio iPSC às células, ressuspenda-as e centrifugue a 400 x g por 5 min em temperatura ambiente.
      1. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 ml de meio iPSC. Incube essas células ressuspensas em um prato fresco de 10 cm e retorne à incubadora por 30 min.
         NOTA: Remova as células alimentadoras OP9-DL1-DL4-I-A^b e mantenha os iPSCs diferenciados na mídia. Mantenha as células^B OP9-DL1-DL4-I-A continuamente para atingir 80 - 90% de confluência para co-cultura adicional.
      2. Após 30 minutos, colete as células flutuantes, filtre-as através de um filtro de células de 70 μm e conte-as com um hemocitômetro.
   5. Semeie 5 x 10⁵ de iPSCs em um novo 80 - 90% confluente de células OP9-DL1-DL4-I-A^b em meio OP9. Suplementar o meio com mFlt-3L a uma concentração final de 5 ng/ml.
   6. Tripsinizar os três tipos de células da placa de 10 cm e ressuspender as células de cada placa de 10 cm em 10 ml de meio fresco. Adicione as células a uma placa fresca de 10 cm e retorne à incubadora por 30 min. Após 30 min, colete células flutuantes.
   7. Passe as células por um filtro de células de 70 μm para remover aglomerados de células e conte usando um hemocitômetro. Ajustar as células para uma concentração de 1,5 x 10⁷ células/ml em PBS frio e filtrar novamente, se necessário. Mantenha as células no gelo até que as células adotivas sejam transferidas para os camundongos.
   8. Injectar 200 μl da suspensão celular (3 x 10,⁶ células) em três grupos diferentes de ratinhos C57BL/6 fêmeas de 4 a 6 semanas através da veia da cauda.
   9. No dia 10, após a transferência celular, injetar camundongos com 100 μg de albumina de soro bovino metilado (mBSA) emulsionada no adjuvante completo de Freund na base da cauda usando uma seringa de 1 ml.
   10. No dia 17, anestesiar camundongos usando um vaporizador de isoflurano. Utilize 4 a 5% de isoflurano para indução e 1 a 2% para manutenção. Induzir artrite por injeção intra-articular de 20 μg mBSA em 10 μl de PBS na articulação do joelho esquerdo e de 20 μg de mBSA e 100 μg de ovalbumina total (OVA) em 10 μl de PBS na articulação do joelho direito. Alimentos e uma bolsa de gel podem ser colocados no chão da cama após o desenvolvimento da artrite. Os camundongos serão sacrificados: Escore de Condição Corporal (ECC) de 2/5 ou moribundo, caquexia grave e/ou decúbito persistente (um período de 24 horas) e escore de gravidade de 4. No escore 4, eritema e inchaço grave abrangem o tornozelo, pé e dedos ou anquiloses do membro.
4. Caracterização das iPSCs transduzidas por OT-II TCR/FoxP3.
   1. Use um microscópio fluorescente (20X) para visualizar células DsRed⁺ GFP⁺ vivas não fixadas.
   2. Examine a integração e expressão gênica por Western blot e citometria de fluxo.
5. Ensaio de supressão da artrite
   1. Meça o inchaço de ambos os joelhos dos camundongos antes da indução da artrite usando um paquímetro de discagem para estabelecer uma linha de base.
   2. Siga as etapas (1.3.1 - 1.3.10) para indução de artrite e transferência de Treg. Meça os joelhos do mouse com um paquímetro de discagem pós-transferência Treg.
   3. Calcule o aumento percentual no diâmetro do joelho: Aumento percentual = (Diâmetro do joelho no dia 1 - Diâmetro do joelho no dia 0) / Diâmetro do joelho no dia 0.
6. Mensuração da destruição articular e infiltração de células inflamatórias nos joelhos por histologia (Figura 1).
   1. No dia 7 após a indução da artrite, eutanasiar os camundongos por inalação de dióxido de carbono (CO₂) seguida de luxação cervical. Remova os pelos dos joelhos com uma tesoura elétrica e excise os joelhos por procedimento cirúrgico.
   2. Remova a pele das pernas fazendo uma incisão na perna traseira com uma tesoura de ponta romba e corte a pele na coxa e até o tornozelo. Retire suavemente a pele sobre a perna e o pé para expor o músculo. Remova o músculo da perna com cuidado sem danificar a articulação do joelho.
      1. Corte a perna traseira logo acima da articulação pélvica / quadril e corte a tíbia usando uma tesoura de dissecação afiada.
   3. Fixe os joelhos em formalina a 4% por 48 horas. Descalcifique os joelhos usando ácido fórmico 2,5 M; enxágue três vezes em xileno por 3 min, enxágue duas vezes em etanol 100%, enxágue duas vezes em etanol a 95%, enxágue duas vezes em água deionizada por 2 min e descalcifique em ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 1 mM. Tratar a uma temperatura de sub-ebulição (90 °C) durante 20 min.
   4. Remova os dois joelhos, fixe em formalina a 10% e calcifique em Formical-4. Incorpore os tecidos em parafina, corte a 4 μm e comine com hematoxilina e eosina (H & E) ou coloração Safranin O e observe ao microscópio.

Resultados

Figura 1: Transferência adotiva de iPSC-Tregs específicos para Ag melhora AIA em camundongos. As iPSCs murinas foram transduzidas com a construção retroviral MiDR, MiDR-FoxP3 ou MiDR-TCR-FoxP3 e foram co-cultivadas nas células OP9-DL1 / DL4 / I-A^b. No dia 7, as células transduzidas pelo gene (3 × 10⁶ / camundongo) foram transferidas adotivamente para camundongos...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Camundongos C57BL/6j	Laboratório Jackson	Episódio 664
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
FBS	Hyclone	SH3007.01
Polibreno	sigma	107689
Genejammer	Ciência integrada	204130
mFlt-3L	PeproTech	250-31L
mIL-7	PeproTech	217-17
mBSA	sigma	Rolamento A7906
Albumina de óvulos	Avantor	0440-01
Cfa	Difco	2017014
Limitador de cauda	Braintree científico	RTV 150-STD
Paraformaldeído	sigma	Rolamento P6148-500G	Cuidado: Alergênico, Carcenogênico, Tóxico