Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Esplenectomia e preparação de células T
Dia 0:
- Despeje 10 ml de meio de células T (TCM) em um cônico de 50 ml e coloque no gelo para coleta do baço.
- Sacrifique o número apropriado de animais por asfixia com CO2 e decapitação secundária: Coloque os animais em uma gaiola recebendo CO2 a uma taxa de fluxo de 10-30% do volume da gaiola/minuto, de acordo com as diretrizes da American Veterinary Medical Association (não mais do que 5 animais podem ser sacrificados simultaneamente) até que a respiração termine e por dois minutos depois. Retirar os animais da câmara de CO2 e decapitar.
nota: Um baço de um camundongo C57BL / 6 fêmea de 6 a 12 semanas produzirá aproximadamente 4,5-5 x 107 esplenócitos. Aqui, 4 baços serão colhidos para aproximadamente 200 x 106 células.
- Coloque o mouse de forma que o lado direito fique voltado para cima e borrife com etanol 70%. Com a pinça, pegue uma fina dobra de pele abaixo da caixa torácica esquerda e faça uma leve incisão com a tesoura. Retire a pele, pegue cuidadosamente uma dobra fina do peritônio com uma pinça e corte uma pequena cavidade.
- O baço é um órgão pequeno, alongado e vermelho escuro que se assemelha a um feijão achatado; agarre delicadamente o baço com a pinça e extirpe cortando o tecido conjuntivo circundante. Colocar os baços excisados no cónico contendo 10 ml de MTC no gelo.
- Despeje os baços sobre um filtro de células de malha de 70 μm e desagregue triturando com a extremidade romba do interior de uma seringa de 5 ml para gerar uma suspensão de célula única. Devem ser desagregados, no máximo, dois baços por filtro de malha.
- Use um pequeno volume de TCM para lavar cuidadosamente o filtro após a desagregação para coletar quaisquer esplenócitos restantes. Agrupe todos os baços desagregados em uma suspensão unicelular. Traga o volume final para 50 ml com TCM para uma lavagem e gire a 300 x g por 10 min.
- Prepare uma solução de tampão de lise 1x adicionando 5 ml de tampão de lise 10x a 45 ml de água estéril. Para eliminar os glóbulos vermelhos, ressuspenda o pellet em 5 ml de tampão de lise 1x por baço em um cônico de 50 ml, misturando bem pipetando suavemente para cima e para baixo. Se exceder 5 baços, use um tubo de centrífuga de 250 ml. Coloque o tubo cônico ou centrífugo em banho-maria a 37 °C por 5 min.
- Remova a reação de lise do banho-maria e adicione TCM na proporção de 1:1 com tampão de lise para neutralizar a reação. Lave centrifugando a 300 x g por 10 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender totalmente o pellet na MTC (2 ml/baço, 8 ml no total para 4 baços) pipetando para cima e para baixo.
- Conte as células adicionando 10 μl de suspensão celular a 190 μl de azul de tripano (diluição 1:20). Multiplique o número obtido em um dos quatro quadrados quadriculados por 20 x 104 x volume total (8 ml) para obter o número total de células (por exemplo, 125 células x 20 x 104 x 8 ml = 200 x 106 esplenócitos).
- Diluir as células até uma concentração de 2 x 106 células/ml em MTC, suplementada com 2 μg/ml de concanavalina A () e 50 UI/ml de interleucina-2 humana recombinante (rhIL-2). Assim, para 200 x 106 esplenócitos, adicione 92 ml de meio a 8 ml de células, 200 μg de e 5.000 UI de rhIL-2.
- Adicione 2 mL de células a cada poço de placas tratadas com cultura de tecidos de 24 poços, de modo que 4 x 106 células estejam em cada poço (por exemplo, 100 ml de células exigirão aproximadamente 4 placas).
- Incubar durante a noite a 37 °C com 5% de CO2.
2. Transdução
Dia 1:
- Calcule o número de placas de 24 poços não tratadas com cultura de tecidos necessárias para a transdução multiplicando o número de baços colhidos por 2 (são necessárias 8 placas para 4 baços).
- Em seguida, calcule o volume necessário de solução de fragmento de fibronectina humana recombinante (RHFF) necessário para revestir as placas multiplicando (número total de poços + 3) x 0,5 ml (8 placas x 24 poços = 192 + 3 = 195) x 0,5 ml = 97,5 ml.
- Prepare 97,5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo RHFF a uma concentração de 25 μg/ml, multiplicando o volume total por 25 μg (97,5 x 25 = 2437,5 μg). Adicione esta quantidade de RHFF a 97,5 ml de PBS.
- Revestir placas de 24 poços tratadas sem cultura de tecidos adicionando 0,5 ml de solução de PBS/RHFF por poço.
- Incubar durante a noite a 4 °C.
Dia 2:
- Despeje a solução de PBS/RHFF de placas de 24 poços não tratadas com cultura de tecidos.
- Adicione 1 ml / poço de albumina de soro bovino a 2% (BSA) em PBS e incube em temperatura ambiente por 30 min.
- Remova o BSA levantando firmemente a placa. Lave adicionando 2 ml de PBS.
- Colete o sobrenadante viral transferindo o meio de cada placa revestida com 293T (HEK293T)-poli-D-lisina (PDL) do rim embrionário humano para um tubo de centrífuga de 250 ml e gire 10 min a 500 x g.
- Transferir cuidadosamente o sobrenadante viral para um novo tubo de centrifugação de 250 ml, tendo o cuidado de não perturbar o sedimento celular que se possa ter formado.
- Adicionar TCM fresco ao sobrenadante viral de modo a que o volume final seja 3 ml superior à quantidade necessária para os alvéolos revestidos com FFRH. Por exemplo, para 192 alvéolos revestidos com FFSD, elevar o volume de sobrenadante viral para 192 + 3 ml = 195 ml.
- Remova os esplenócitos cultivados da incubadora e ressuspenda pipetando suavemente para cima e para baixo 2 a 3 vezes em cada poço. Transferir para uma cónica de 250 ml. Se estiver usando uma pipeta multicanal, usar um reservatório estéril antes da transferência ajudará a agilizar esta etapa. Conte conforme descrito anteriormente e gire a 300 x g por 10 min.
- Adicione interleucina-2 humana recombinante (rhIL-2) ao sobrenadante viral a uma concentração de 50 UI / ml. Por exemplo, adicione 50 x 195 = 9.750 UI de rhIL-2 a 195 ml de sobrenadante viral.
- Ressuspender os esplenócitos no sobrenadante viral a 1 x 106 células/ml
- Adicionar 1 ml/alvéolo de suspensão de esplenócitos a placas de 24 poços revestidas com RHFF.
- Centrifugar durante 90 min de acordo com as seguintes regulações: 770 x g, aceleração = 4, travagem/desaceleração = 0, 32 °C.
- Prepare uma solução de MTC com 50 UI/ml de rhIL-2. Por exemplo, prepare uma solução de 200 TCM adicionando 10.000 UI de rhIL-2. Adicionar 1 ml de rhIL-2/TCM a cada alvéolo após centrifugação.
- Cultura durante a noite a 37 °C em 5% CO2.
3. Cultura e colheita de células T CAR
Dias 3 e 4:
- Se as células T atingirem >80% de confluência, as células podem ser divididas (isso geralmente ocorre no dia 3 ou no dia 4). Para dividir as células, pipete suavemente para cima e para baixo em cada poço 2-3 vezes e mova 1 ml de cada poço para novos poços de uma placa nova tratada com cultura de tecidos de 24 poços. Em seguida, adicione 1 ml de TCM fresco com 50 UI/ml de IL-2 a cada poço, de modo que o volume final seja de 2 ml em todos os alvéolos.
- Se as células não atingirem >80% de confluência, execute uma meia troca de meio pipetando lentamente 1 ml de meio do topo de cada poço. Evite perturbar as células depositadas na parte inferior enquanto remove a mídia. Adicionar 1 ml de MTC fresca contendo 50 UI/ml de rhIL-2.
Dia 5:
- Ressuspenda as células T CAR pipetando suavemente para cima e para baixo 3 vezes em cada poço e transfira para um tubo de centrífuga de 250 ml. Gire as células a 300 x g por 10 min.
- Aspirar completamente o sobrenadante sem perturbar o grânulo. Lave uma vez com PBS, conte as células conforme descrito anteriormente e lave com PBS uma segunda vez. Um rendimento típico de células T CAR é de aproximadamente 1 x 106 células por poço (8 placas x 24 poços = 192 x 106 células CAR T).
- Ressuspenda as células em PBS a uma concentração de 5 x 107 / ml para uma injeção de 1 x 107 em um volume de 200 μg (por exemplo, para células T CAR 192 x 106, ressuspenda o pellet lavado em 3,84 ml de PBS).
