Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto. Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Expansão inespecífica de linfócitos T efetores citotóxicos
- Preparar e irradiar células alimentadoras a 35 Gy. Para a estimulação de 2 x 105 - 4 x 105 células efetoras, prepare 10 x 106 células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) e 1 x 106 linhas celulares linfoblastóides B (BLCLs) de três doadores distintos e saudáveis.
- Ressuspenda as células alimentadoras e as células efetoras em 15 mL de meio do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com 10% de soro fetal inativado pelo calor (FCS), 2 mM de L-glutamina, penicilina (100 UI / mL) e estreptomicina (0,1 μg / mL) e 300 UI / mL de interleucina-2 recombinante (IL-2).
- Adicione a fitohemaglutinina (PHA-L) a uma concentração final de 1 μg / mL, misture cuidadosamente e distribua 150 μL da suspensão celular por poço em placas de fundo em U de 96 poços.
- Incubar a 37 °C e com 5% de CO2 em atmosfera umidificada.
- Verifique diariamente a placa até que grandes aglomerados de células se formem nos poços de cultura (~dia 7).
- Transferir as células para um balão de cultura a 1 x 106 células/ml em meio de cultura fresco.
- Determinar o número total de células por contagem (2x por semana) e mantê-las em 1 x 106 células/mL em meio de cultura fresco.
nota: As células imunes efetoras devem estar prontas para a administração terapêutica em estado de repouso (geralmente 3 semanas após o estímulo inicial de amplificação). A pureza e a reatividade dessas células efetoras devem ser verificadas antes das injeções in vivo (por exemplo, com ensaios in vitro).
2. Preparação de células efetoras pré-operatórias
- Após verificar a contagem de células efetoras, coletar as células efetoras em um tubo de 50 mL por centrifugação (300 x g por 5 min).
nota: Para compensar qualquer perda, prepare um excesso de células (por exemplo, 50 x 106).
- Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células em 15 mL de PBS estéril e centrifugue por 5 min a 300 x g para realizar a lavagem.
- Remova cuidadosa e completamente o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda o pellet celular em 1 mL de PBS estéril.
- Transfira as células ressuspensas em um microtubo de 1,5 mL para centrifugação a 300 x g por 5 min.
- Remova cuidadosa e completamente o sobrenadante pipetando lentamente.
- Ressuspenda o pellet celular em 8 μL de PBS estéril por camundongo.
nota: Este é um passo crítico.
- Meça o volume da suspensão celular usando uma micropipeta. Se necessário, adicione PBS estéril (20 x 106 células em 15 μL de PBS por dose) e misture cuidadosamente.
- Verificar, com uma micropipeta, se o volume final por ratinho se situa entre 15 e 20 μL (imperativamente < 20 μL).
- Mantenha as células no gelo até a injeção estereotáxica.
nota: Mais de 3 pontos de tempo não foram testados.
3. Injeção Estereotáxica
- Configuração do equipamento
- Monte e calibre uma estrutura estereotáxica de pequenos animais de acordo com as instruções do fabricante para garantir a precisão das injeções intracranianas (por exemplo, tamanho da seringa, volume desejado e taxa de injeção).
nota: Recomenda-se uma taxa de infusão lenta (ou seja,., 2 - 3 μL / min).
- Instale o material sob um gabinete de segurança microbiana (MSC) para manter a esterilidade dos instrumentos e proteger os camundongos contra infecções.
nota: Colocar os "blocos isotérmicos" em banho-maria a 37 °C. Este sistema limita a hipotermia de camundongos durante a cirurgia. Almofadas de aquecimento, necessárias para os cuidados pós-procedimento, devem ser usadas durante o monitoramento contínuo da temperatura.
- Preparação pré-operatória do animal
- Anestesiar um camundongo com uma injeção intraperitoneal de cetamina (10 mg / mL) e xilazina (0,1 mg / mL) a 10 μL / g de peso corporal do camundongo.
- Realize um teste de pinça do dedo do pé para garantir a anestesia e analgesia completas do animal.
nota: Qualquer movimento é um indício de analgesia não profunda e, se isso ocorrer, são necessários mais alguns minutos antes de repetir a operação.
- Assim que o mouse estiver devidamente anestesiado, use uma tesoura para remover o pelo do local da cirurgia (entre as duas orelhas, até o nariz).
- Preparação pré-operatória de células
- Ressuspenda cuidadosamente as células com uma pipeta (várias vezes) antes de cada injeção para evitar qualquer aglomeração celular.
- Aspire cuidadosamente o volume de suspensão celular necessário (15 - 20 μL) na microsseringa de 22 G para evitar a aspiração de bolhas.
nota: Essa etapa de carregamento celular na microsseringa é importante para minimizar as variações nos volumes injetados. Recarregue as células para cada injeção individual entre os procedimentos para evitar qualquer aglomeração de células e garantir um número par de administração de células efetoras na coorte.
- Em seguida, coloque a seringa na bomba de seringa adaptada.
- Cuidados processuais
- Desinfete o local da cirurgia com swabs embebidos em solução de iodopovidona a 5% pelo menos 3x.
- Coloque uma pomada oftálmica lubrificante nos olhos do camundongo para evitar o ressecamento das córneas.
- Posicione o camundongo anestesiado na estrutura estereotáxica, em um bloco isotérmico quente coberto com um filme plástico estéril para manter a temperatura do camundongo durante a cirurgia e limitar a mortalidade.
nota: O nariz e os dentes do camundongo devem ser posicionados adequadamente acima da barra do dente, para garantir o fluxo respiratório adequado durante o procedimento.
- Assim que o mouse estiver posicionado acima da barra do dente, aperte as barras auriculares firmemente sob as orelhas do mouse para imobilizar a cabeça.
nota: Tenha cuidado para não danificar os tímpanos ou comprometer a respiração.
- Faça uma incisão na pele sagital da linha média de 1 a 2 cm com uma tesoura estéril ao longo da parte superior do crânio de anterior a posterior para expor o crânio.
- Identifique a interseção das suturas sagital e coronal (Bregma) para servir como pontos de referência para localização estereotáxica antes da injeção (mostrado na Figura 1).
- Coloque a microsseringa acima deste ponto.
- Mova a microsseringa 2 mm para a lateral direita e 0,5 mm para a frente do Bregma.
- Usando uma microbroca, faça um pequeno orifício no crânio com uma broca estéril em coordenadas predeterminadas. Tenha o cuidado de permanecer superficial para evitar qualquer lesão traumática do cérebro.
nota: Neste protocolo, as células imunes foram injetadas dentro de um tumor estabelecido (uma semana após a injeção de células tumorais). A pele deve ser reaberta (cicatriz) e a injeção é realizada nas mesmas coordenadas usadas para a implantação da célula tumoral (o orifício geralmente ainda está presente até 2 semanas após a injeção). As coordenadas foram selecionadas para a injeção de células tumorais e efetoras no parênquima cerebral.
- Injeção de células efetoras imunes
- Insira cuidadosamente a microsseringa no orifício perfurado e, movendo-se lentamente, avance a agulha 3 mm para baixo na dura-máter e depois para trás 0,5 mm até uma profundidade final de 2,5 mm antes de injetar as células efetoras.
- Execute a injeção de células efetoras a 2 - 3 μL / min e monitore os camundongos durante todo o tempo de injeção.
- Quando a injeção estiver concluída, retire a agulha por apenas 1 mm e mantenha a microsseringa no lugar por mais um minuto antes de retirar lentamente a microsseringa completamente, para evitar qualquer vazamento do local da infusão.
nota: Após a remoção do animal do dispositivo estereotáxico, limpe imediatamente o equipamento de injeção para os próximos experimentos.
- Cuidados pós-operatórios e acompanhamento de camundongos
- Retirar o animal da estrutura estereotáxica e aplicar imediatamente solução de iodopovidona a 5% no local da incisão e fechar a pele com sutura cirúrgica apropriada.
- Aplique o gel de lidocaína a 2% diretamente na ferida e administre 0,15 μg/g de buprenorfina por injeção subcutânea para analgesia pós-procedimento.
- Coloque o camundongo anestesiado de volta em sua gaiola acima de uma almofada de aquecimento ajustada para 37 °C para manter uma temperatura corporal adequada do camundongo e evitar qualquer hipotermia.
nota: Não é necessário um alojamento separado.
- Monitore o mouse até que ele esteja totalmente recuperado da anestesia e transfira-o para uma sala de alojamento.
nota: Até o momento, este protocolo é bem suportado, pois ocorreram poucas complicações imprevistas (< 5% dos camundongos injetados).
- Monitore diariamente os camundongos e os sacrifique quando forem observados sinais de saúde em declínio (por exemplo, postura curvada, mobilidade reduzida, prostração ou perda significativa de peso corporal [≥ 15%]).
