Células T CAR geneticamente modificadas usando um sistema CRISPR-Cas9

Resumo

Fonte: Sterner, R. M. et al., Usando CRISPR/Cas9 para eliminar GM-CSF em células CAR-T.J. Vis. Exp. (2019)

O vídeo descreve um processo para criar células CAR T geneticamente modificadas por meio do Sistema CRISPR-Cas9. Infectar células T com lentivírus CRISPR e CAR resulta em modificações no gene alvo e na síntese de um receptor de antígeno quimérico ou CAR, levando à formação de células T CAR geneticamente modificadas.

Protocolo

1. Produção de células CART19

1. Isolamento, estimulação e cultura ex-vivo de células T
   1. Realize todo o trabalho de cultura de células em uma capa de cultura de células utilizando equipamento de proteção individual apropriado. Colher células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de cones de sangue de doadores normais não identificados coletados durante a aférese, pois são conhecidos por serem uma fonte viável de PBMCs.
   2. Para isolar PBMCs, adicione 15 mL de um meio de gradiente de densidade a um tubo de separação de gradiente de densidade de 50 mL. Dilua o sangue do doador com um volume igual de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) para evitar o aprisionamento celular.
      1. Adicione o sangue diluído do doador do cone ao tubo de separação, com cuidado para não perturbar a interface entre o sangue e o meio de gradiente de densidade. Centrifugue a 1.200 x g por 10 min em RT.
      2. Transvase o sobrenadante em um novo cônico de 50 mL, lave com PBS + 2% de FBS trazendo até 40 mL, centrifugue a 300 x g por 8 min em RT, aspire o sobrenadante, ressuspenda em 40 mL de tampão e conte as células.
   3. Isole as células T dos PBMCs por meio de um kit de esferas magnéticas de seleção negativa usando um separador de células totalmente automatizado de acordo com o protocolo do fabricante.
   4. Para cultivar as células T isoladas, prepare o meio de células T (MTC) que consiste em 10% de soro AB humano (v/v), 1% de penicilina-estreptomicina-glutamina (v/v) e meio de células hematopoiéticas sem soro. Esterilize o meio filtrando através de um filtro de vácuo estéril de 0,45 μm e, em seguida, com um filtro de vácuo estéril de 0,22 μm.
   5. No dia 0 (o dia da estimulação das células T), lave as esferas CD3 / CD28 antes da estimulação das células T. Para lavar, coloque o volume necessário de contas (use contas CD3/CD28 suficientes para uma proporção de 3:1 contas: células T; observe que a concentração de grânulos pode ser variável) em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL e ressuspender em 1 mL de MTC.
   6. Coloque em contato com um ímã.
   7. Após 1 min, aspire o TCM e ressuspenda em 1 mL de TCM fresco para lavar os grânulos.
   8. Repita este procedimento para um total de três lavagens.
   9. Após a terceira lavagem, ressuspenda os grânulos em 1 mL de TCM.
   10. Conte as células T.
   11. Transfira os grânulos para as células T na proporção de 3:1 grânulos:células.
   12. Diluir as células até uma concentração final de 1 x 10⁶ células/ml.
   13. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ por 24 h.
2. Transfecção e transdução de células T
   1. Realize o trabalho lentiviral usando as precauções BSL-2+, incluindo capuzes de cultura de células, equipamentos de proteção individual e desinfecção de materiais usados com alvejante antes do descarte.
   2. Adquira uma construção quimérica do receptor de antígeno-T19 (CART19) em um vetor lentiviral.
      nota: A construção CART19 utilizada aqui foi projetada e sintetizada de novo usando um fornecedor de síntese de proteínas disponível comercialmente. A construção CAR foi posteriormente clonada em um lentivírus de terceira geração sob controle de um promotor EF-1α. O fragmento de região variável de cadeia única é derivado do clone FMC63 e reconhece o CD19 humano. A construção CAR19 possui um domínio coestimulatório 4-1BB de segunda geração e estimulação CD3ζ (FMC63-41BBz).
   3. Realize a produção lentiviral conforme descrito anteriormente.
      1. Em resumo, para produzir lentivírus, utilize células 293T que atingiram 70-90% de confluência.
      2. Deixe a incubação por 30 min em temperatura ambiente de reagentes de transfecção, incluindo 15 μg do plasmídeo lentiviral de interesse, 18 μg de um vetor de embalagem gag / pol / tat / rev, 7 μg de um vetor de envelope VSV-G, 111 μL do reagente de pré-complexação, 129 μL do reagente de transfecção e 9,0 mL do meio de transfecção antes de adicionar às células 293T. Em seguida, cultive as células transfectadas a 37 °C, 5% de CO₂.
      3. Colher, centrifugar (900 x g por 10 min), filtrar (filtro de nylon 0,45 μM) e concentrar o sobrenadante em 24 e 48 h por ultracentrifugação a 13.028 x g por 18 h ou 112.700 x g por 2 h.
      4. Congelar a -80 °C para uso futuro.
   4. No Dia 1, ressuspenda suavemente as células T para quebrar as rosetas de células T que foram estimuladas a 1 x 10⁶ / mL no Dia 0.
   5. Sob as precauções BSL-2+ apropriadas para todo o trabalho lentiviral, adicione o vírus colhido fresco ou congelado às células T estimuladas em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 3,0.
3. Expansão de células T CAR
   1. Durante a fase de expansão, continue a incubar as células T transduzidas a 37 °C, 5% de CO₂. Conte as células T CAR nos dias 3 e 5 e adicione TCM fresco e pré-aquecido à cultura para manter uma concentração de células T CAR de 1 x 10⁶ / mL.
   2. Remova as esferas das células T transduzidas 6 dias após a estimulação (Dia 6) usando um ímã. Colha, ressuspenda e coloque as células T em tubos cônicos de 50 mL em um ímã por 1 min. Em seguida, colete o sobrenadante (contém as células T CAR) e descarte as contas.
   3. Coloque as células T CAR coletadas de volta em cultura a uma concentração de 1 x 10⁶ células/mL para retomar a expansão.
   4. No dia 6, avalie a expressão superficial do CAR por citometria de fluxo.
      nota: Vários métodos podem ser usados para detectar a expressão superficial de CAR, como a coloração com um anticorpo secundário de IgG (H+L) de cabra anti-camundongo adsorvido ou a coloração com um peptídeo específico para CD19, conjugado a um fluorocromo. Aqui, pegue uma alíquota (cerca de 100.000 células T) da cultura e lave com tampão de fluxo preparado com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, soro bovino fetal a 2% e azida sódica a 1%. Pinte as células com o anticorpo anti-CAR e lave duas vezes. Manchar as células com coloração viva/morta e anticorpo monoclonal CD3 (OKT3). Lave as células e ressuspenda em tampão de fluxo. Adquira em um citômetro para determinar a eficiência da transdução.
4. Criopreservação de células T CAR
   1. Para colher e criopreservar células T CAR 8 dias após a estimulação (dia 8 de expansão das células T), colha as células da cultura.
   2. Gire para baixo por 5 min a 300 x g.
   3. Ressuspender em meio de congelamento a 10 milhões de células por mL por frasco para injetáveis em meio de congelamento consistindo de 10% de dimetilsulfóxido e 90% de soro fetal bovino.
   4. Congelar num recipiente de congelação para atingir uma taxa de arrefecimento de -1 °C/min num congelador de -80 °C e, em seguida, transferir para azoto líquido após 48 h.
   5. Antes de seu uso para experimentos in vitro ou in vivo, descongele as células T CAR em MTC quente.
   6. Lave as células para diluir e remover o dimetilsulfóxido e ressuspenda a uma concentração de 2 x 10⁶ células / mL em TCM quente. Descanse durante a noite a 37 °C, 5% CO₂.

2. Produção de CART19 do fator estimulador de colônias de macrófagos de granulócitos (GM-CSF ^k/o)

1. Para interromper o GM-CSF, utilize um RNA guia (gRNA) direcionado ao éxon 3 do GM-CSF humano (CSF2) selecionado por meio de gRNAs de triagem relatados anteriormente como tendo alta eficiência para o gene CSF2 que codifica a citocina humana GM-CSF.
   nota: Foi utilizada uma construção lentiviral de terceira geração Cas9 de grau de pesquisa sintetizada comercialmente contendo este gRNA (sob um promotor U6). A construção contém um gene de resistência à puromicina. A sequência do gRNA é GACCTGCCTACAGACCCGCC.
2. Para produzir lentivírus, utilize células 293T que atingiram 70-90% de confluência.
3. Permitir 15 μg do plasmídeo lentiviral de interesse, 18 μg de um vetor de embalagem gag/pol/tat/rev, 7 μg de um vetor de envelope VSV-G, 111 μL do reagente pré-complexante, 129 μL do reagente de transfecção e 9,0 mL do meio de transfecção para incubar por 30 min à temperatura ambiente.
4. Adicione reagentes de transfecção às células 293T. A cultura a 37 °C, 5% de dióxido de carbono (CO₂).
5. Colher, centrifugar (900 x g por 10 min), filtrar (filtro de nylon 0,45 μM) e concentrar o sobrenadante em 24 e 48 h por ultracentrifugação a 13.028 x g por 18 h ou 112.700 x g por 2 h e congelar a -80 ° C para uso futuro.
6. No dia 1, ressuspenda suavemente as células T para quebrar as rosetas.
7. Em um laboratório aprovado pelo BSL-2+, adicione um vírus congelado ou recém-colhido às células T estimuladas para gerar células T CAR. Transduza células T com o lentivírus CAR19 e GM-CSF direcionado ao lentivírus CRISPR. Adicione lentivírus CAR19 em um MOI de 3. Como a titulação do lentivírus CRISPR não era viável, use partículas de vírus geradas a partir de uma preparação de plasmídeo de 15 ug para transduzir células T 10 x 10⁶.
8. Veja as etapas restantes de estimulação, expansão e criopreservação de células T, conforme discutido na etapa 1.
9. Para células T editadas por lentiCRISPR que carregam resistência à puromicina, trate as células com dicloridrato de puromicina a uma concentração de 1 μg de puromicina por 1 mL no dia 3 e no dia 5.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo monoclonal CD3 (OKT3), PE, eBioscience	Invitrogen	12-0037-42
Anticorpo Monoclonal CD3 (UCHT1), APC, eBioscience	Invitrogen	17-0038-42
Escolha Taq Blue Mastermix	Denville Científico	C775Y51
CTS (Sistemas de Terapia Celular) Dynabeads CD3/CD28	Gibco	40203D
Sistema CytoFLEX B4-R2-V2	Beckman Coulter	C10343	Citômetro de fluxo
Dimetilsulfóxido	Millipore Sigma	D2650-100ML
salina tamponada com fosfato de Dulbecco	Gibco	14190-144
Dynabeads MPC-S (Concentrador de Partículas Magnéticas)	Biossistemas Aplicados	A13346
Ímã Easy 50 EasySep	Tecnologias STEMCELL	Rolamento 18002
Kit de isolamento de células T humanas EasySep	Tecnologias STEMCELL	Rolamento 17951	Esferas magnéticas de seleção negativa; 17951RF inclui pontas e tampão
Soro fetal bovino	Millipore Sigma	F8067
Mouse FITC Anti-Humano CD107a	BD Pharmingen	Rolamento 555800
Meio de Fixação (Médio A)	Invitrogen	GAS001S100
Construção GenCRISPR gRNA: Nome: CSF2	GenScript	N/A	Pedido personalizado
RNA guia CRISPR 1; Espécie: Humano, Vetor:
pLentiCRISPR v2; Resistência: Ampicilina; Número da cópia:
alto; Preparação de plasmídeo: Entrega padrão: 4 μg (Livre
de carga)
Anticorpo secundário de adsorção cruzada IgG (H+L) de cabra anti-camundongo, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21235
https://tide.nki.nl.	Genética de desktop
Soro AB Humano; Doadores do sexo masculino; tipo AB; Nos	Corning	35-060-CI
IFN gama Monoclonal Anticorpo (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience	Invitrogen	Telefone: 47-7319-42
Reagente de Transfecção Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000075
Kit de coloração de células mortas Aqua corrigível LIVE/DEAD, para excitação de 405 nm	Invitrogen	L34966
Linfoprep	Tecnologias STEMCELL	Nº 7851
Solução Monensina, 1000X	BioLegend	420701
Clone anti-humano CD28 CD28.2 do rato	BD Pharmingen	Rolamento 559770
Clone anti-humano 9F10 do clone de CD49d do rato	BD Pharmingen	561892
Camundongo anti-humano MIP-1β PE-Cy7	BD Pharmingen	560687
Recipiente de congelamento Mr. Frosty	Thermo Científico	Rolamento 5100-0001
NALM6, clone G5	ATCC	CRL-3273	Linha celular de leucemia linfoblástica aguda
Água livre de nuclease	Promega	Pág. 119C
Sistemas de filtro a vácuo Olympus, 500 mL, membrana PES, 0,22 uM, estéril	Genesee Científico	25-227
Sistemas de filtro a vácuo Olympus, 500 mL, membrana PES, 0,45 uM, estéril	Genesee Científico	25-228
Opti-MEM I Meio de Soro Reduzido (1X), Líquido	Gibco	Rolamento 31985-070
PE-CF594 Camundongo Anti-Humano IL-2	BD Horizon	562384
Penicilina-estreptomicina-glutamina (100X), líquido	Gibco	10378-016
Meio de permeabilização (meio B)	Invitrogen	GAS002S100
Mini kit de DNA genômico PureLink	Invitrogen	K182001
Dicloridrato de puromicina	MP Biomedicals, Inc.	210055210
Kit de extração de gel QIAquick	QIAGEN	Rolamento 28704
Rato Anti-Humano GM-CSF BV421	BD Horizon	Rolamento 562930
RoboSep-S	Tecnologias STEMCELL	21000	Separador de células totalmente automatizado
SepMate-50 (IVD)	Tecnologias STEMCELL	Rolamento 85450
Azida de sódio, 5% (p / v)	Ricca Química	7144.8-16
X-VIVO 15 Meio de Células Hematopoiéticas Sem Soro	Lonza	04-418Q