Uma técnica CRISPR-Cas9 para edição de genes em células T

Neste artigo

Resumo

Fonte: Agarwal, S., et al. Produção de células CAR-T humanas projetadas por CRISPR. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra um ensaio para realizar a edição de genes em células T humanas usando a tecnologia CRISPR-Cas9. Uma mistura de células T CD4+ e CD8+ primárias é combinada com um complexo ribonucleoproteico CRISPR-Cas9, visando genes específicos para nocaute. Após a eletroporação, o sgRNA guia Cas9 para a sequência de DNA alvo, criando cortes precisos. Esses cortes são então reparados pelo mecanismo de junção final não homólogo da célula, levando ao nocaute do gene.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Desenho de sgRNAs e ruptura gênica em células T humanas primárias

Projetando sgRNAs CRISPR
nota: Vários servidores e programas facilitam o projeto de RNAs guia único (sgRNA) específicos do alvo. Neste protocolo, sgRNAs de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) foram projetadas usando CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) e o portal de design de gRNA do Broad Institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-too....

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Resultados

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Figura 1. Expansão de células CAR-T editadas e suas duplicações populacionais. (A) Linha do tempo da edição e fabricação de CRISPR em células CART humanas primárias. (B) Duplicações populacionais em células CAR-T CD19 editadas por Mockr e CRISPR medidas usando um contador de relha durante a expansão das células CAR-T (n = 3 doadores saudáveis; KO = n.......