Uma técnica CRISPR-Cas9 para edição de genes em células T

Neste artigo

Resumo

Fonte: Agarwal, S., et al. Produção de células CAR-T humanas projetadas por CRISPR. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra um ensaio para realizar a edição de genes em células T humanas usando a tecnologia CRISPR-Cas9. Uma mistura de células T CD4+ e CD8+ primárias é combinada com um complexo ribonucleoproteico CRISPR-Cas9, visando genes específicos para nocaute. Após a eletroporação, o sgRNA guia Cas9 para a sequência de DNA alvo, criando cortes precisos. Esses cortes são então reparados pelo mecanismo de junção final não homólogo da célula, levando ao nocaute do gene.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Desenho de sgRNAs e ruptura gênica em células T humanas primárias

Projetando sgRNAs CRISPR
nota: Vários servidores e programas facilitam o projeto de RNAs guia único (sgRNA) específicos do alvo. Neste protocolo, sgRNAs de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) foram projetadas usando CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) e o portal de design de gRNA do Broad Institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
1. Para cada gene alvo, projete de seis a dez sequências de sgRNA para direcionar sequências de éxons codificantes iniciais.
  NOTA: o sgRNA deve ter alta eficácia no alvo e baixa eficácia fora do alvo. Cada algoritmo de aprendizado de máquina para determinar a eficácia do sgRNA funciona de maneira ligeiramente diferente. Portanto, recomenda-se comparar várias ferramentas de design de sgRNA e selecionar uma lista de seis a dez sgRNA para triagem.
Ruptura gênica em células T humanas primárias
1. Obtenha células mononucleares autólogas do sangue periférico (PBMCs) de doadores voluntários saudáveis. Uma linha do tempo esquemática do protocolo é descrita na Figura 1A e descrita abaixo.
2. Isole as células T CD4+ e CD8+ usando kits de seleção CD4 e CD8 disponíveis comercialmente.
3. Combine células T CD4+ e CD8+ na proporção de 1:1 e incube durante a noite a 3x10⁶ células/mL em R10 suplementado com 5 ng/mL de interleucina-7 humana (huIL-7) e interleucina-15 humana (huIL-15) cada. A adição de IL-7 e IL-15 é recomendada, pois são conhecidas por promover um fenótipo de memória central e as células T do receptor de antígeno quimérico (CAR)-T expandidas com IL-7 e IL-15 têm eficácia antitumoral superior em comparação com as células CAR-T expandidas com interleucina-2 (IL-2).
4. No dia seguinte, conte as células T e centrifugue 5-10 x 10⁶ células a 300 x g por 5 min. Descarte todo o sobrenadante e lave o pellet celular em meio essencial mínimo de soro reduzido. Ressuspenda o pellet em 100 μL de solução de nucleofecção de acordo com as instruções do fabricante (Tabela de Materiais).
5. Enquanto lava as células, prepare o complexo ribonucleoproteico (RNP) com a proteína 9 associada a CRISPR (Cas9) e gRNA incubando 10 μg de nuclease Cas9 com 5 μg de sgRNA por 10 min em temperatura ambiente (RT). A razão molar de Cas9 para sgRNA é de 1:2,4. Recomenda-se um controle simulado que contenha Cas9 e um intensificador de eletroporação, mas nenhum sgRNA.
  nota: A edição de genes multiplex pode ser realizada nesta etapa fazendo complexos RNP para cada alvo separadamente e combinando-os com células no momento da nucleofecção, conforme descrito na próxima etapa. A escolha dos reagentes para montar o complexo RNP é fundamental para obter alta eficiência de nocaute (KO). Por exemplo, as nucleases Cas9 de diferentes fornecedores têm efeitos fora do alvo variados, e o gRNA quimicamente modificado diminui a toxicidade para as células T, aumentando assim a eficiência do KO.
6. Combine as células ressuspensas da etapa 1.2.4 com o complexo RNP da etapa 1.2.5 e adicione 4,2 μL de intensificador de eletroporação de 4 μM (oligonucleotídeo de DNA de fita simples [ssDNA] que não é homólogo ao genoma humano). Misture bem e transfira para cubetas de eletroporação. Evite bolhas, pois elas prejudicam a eficiência da eletroporação.
7. Células eletroporosas usando o código de pulso EH111. Após eletroporação, incubar células em R10 suplementadas com 5 ng/mL de huIL-7 e huIL-15 a 5x10⁶ células/mL a 30 °C por 48 h em placas de 12 poços. Após 48 h, prossiga com a ativação e expansão das células T.

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Resultados

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Figura 1. Expansão de células CAR-T editadas e suas duplicações populacionais. (A) Linha do tempo da edição e fabricação de CRISPR em células CART humanas primárias. (B) Duplicações populacionais em células CAR-T CD19 editadas por Mockr e CRISPR medidas usando um contador de relha durante a expansão das células CAR-T (n = 3 doadores saudáveis; KO = n...