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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Alojamento e manutenção de ratos
- Compre camundongos NSG de 6 a 8 semanas (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ).
- Aloje os camundongos em condições de FPS com troca de ar, pré-filtros e filtros de ar particulado de alta eficiência (HEPA) (0,22 μm) em uma sala com temperatura, umidade e pressão controladas.
- Alojar e manter os camundongos em gaiolas de microisoladores individuais autoclavadas em um sistema de rack capaz de gerenciar a troca de ar com pré-filtros e filtros HEPA (0,22 μm).
- Realizar todos os procedimentos e manipulações dos camundongos em uma capela de segurança biológica de Classe II Tipo A2 que tenha sido pré-tratada com etanol a 70%. Antes de trabalhar na sala dos animais, tome banho e vista uniformes limpos, traje Tyvek, capas de botas, touca de cabelo, máscara facial e luvas. Use um avental cirúrgico sobre o traje Tyvek durante os procedimentos cirúrgicos.
nota: A descontaminação por luz ultravioleta (UV) também é preferida antes dos procedimentos.
- Autoclave todos os instrumentos e reagentes, se possível, e desinfete-os antes de transferi-los para a hotte.
- Durante os procedimentos, remova as gaiolas ventiladas individualmente dos animais do rack e desinfete-as antes de transferi-las para a capela
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- Alimente os ratos com uma dieta irradiada e forneça água autoclavada. Forneça alimentos irradiados e complemente alimentos irradiados adicionais, conforme necessário. Troque a água autoclavada semanalmente ou conforme necessário.
nota: Água acidificada autoclavada também pode ser usada. A dieta irradiada fornecida teve uma vida útil de 6 meses após a fabricação.
2. Geração de camundongos humanizados de medula óssea, fígado e timo (BLT)
NOTA: A geração de camundongos hu-BLT foi descrita anteriormente.
- No dia da cirurgia, dê aos camundongos irradiação de corpo inteiro na dose de 12 cGy / g de peso corporal.
- Prepare os ratos para a cirurgia.
- Dê a cada camundongo irradiado uma mistura de cetamina na concentração de trabalho de 100 mg / kg e xilazina na concentração de 12 mg / kg, que variou de 130-170 μL por camundongo com base no peso corporal por injeção intraperitoneal (IP) para anestesia. Para preparar 3 ml da mistura de cetamina e xilazina, adicione 0,27 mL de cetamina na concentração estoque de 100 mg / mL e 0,03 mL de xilazina na concentração de 100 mg / mL a 2,7 mL de solução salina estéril e misture bem. Desinfete a pele com isopropanol a 70% antes da injeção.
- Dê a cada camundongo irradiado Buprenorfina 1 mg / kg de peso corporal (semi-vivo 72 h, SR-LAB) por injeção subcutânea para controle duradouro da dor.
- Dê a cada camundongo irradiado 100 μL (858 μg) de cefazolina por injeção IP para profilaxia antibiótica pré-operatória.
- Raspe o cabelo dos camundongos usando uma máquina de cortar cabelo elétrica ao redor do lado lateral esquerdo e medial do camundongo no local cirúrgico posterior usado para expor o rim esquerdo.
- Verifique o nível adequado de anestesia por reflexo pedal (pinça firme do dedo do pé).
- Administre isoflurano a 3-5% se for necessária anestesia adicional a qualquer momento durante a cirurgia.
- Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar a dessecação da córnea. Aplique uma marca auricular, se necessário.
- Realize a cirurgia para implantar os tecidos do fígado e do timo na cápsula do rim esquerdo.
- Desinfete a pele no local da cirurgia aplicando esfoliante de iodo começando do centro do local da cirurgia e movendo-se para o exterior de forma circular. Repita este processo com isopropanol a 70% e uma terceira vez com iodo.
- Usando uma pinça, primeiro carregue um fragmento de tecido hepático fetal humano em um trocarte. Em seguida, usando uma pinça, carregue um fragmento de tecido do timo fetal humano no trocarte. Em seguida, usando uma pinça, carregue outro fragmento de tecido hepático fetal humano no trocarte. Os tecidos devem ser cortados em 1-1,6 mm3 para se ajustarem às dimensões internas do trocarte.
- Use uma pinça para levantar a pele e uma tesoura para fazer um pequeno corte longitudinalmente. Estenda o corte para 1,5-2 cm no lado esquerdo do mouse.
- Use uma pinça para levantar a camada muscular e uma tesoura para fazer um pequeno corte longitudinalmente. Estenda o corte conforme necessário para expor o rim.
- Exponha o rim segurando suavemente o tecido adiposo ao redor do rim. Não toque diretamente no parênquima renal.
- Faça uma incisão de 1-2 mm na extremidade posterior da cápsula renal usando um bisturi.
- Insira lentamente o trocarte pré-carregado através da incisão paralela ao eixo longo do rim e libere os tecidos entre a cápsula renal e o rim.
- Retorne cuidadosamente o rim e o intestino à sua posição normal. Use suturas absorvíveis 5/0 P-3 (P-13) com agulha circular de 13 mm 3/8 para fechar a camada muscular e grampos cirúrgicos para fechar a pele.
- Após a cirurgia, coloque o camundongo em uma gaiola microisolatra autoclavada limpa para recuperação.
- Para minimizar a perda de calor durante a recuperação pós-cirúrgica, coloque a gaiola contendo os ratos em uma almofada de aquecimento conectada a uma bomba d'água que aquece e circula a água.
- Monitore os camundongos até que eles recuperem a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
- Dentro de 6 h após a conclusão da cirurgia, através da veia da cauda, injete células-tronco hematopoiéticas CD34+ isoladas do tecido hepático fetal humano.
- Aqueça os ratos com uma lâmpada de calor. Desinfete a cauda com isopropanol a 70% e, em seguida, injete 1,5 a 5 × 105 células-tronco/200 μL na veia da cauda.
- Pare qualquer sangramento da injeção e retorne os camundongos para a gaiola do microisolador e a gaiola do microisolador para o suporte da gaiola.
nota: Os camundongos pós-cirúrgicos são normalmente alojados juntos, cinco por gaiola de microisolador, durante e após a recuperação. No entanto, os camundongos só são alojados juntos se todos forem operados no mesmo dia.
- Verifique os ratos diariamente. Monitore cuidadosamente os grampos cirúrgicos e substitua-os conforme necessário. Monitore de perto os ratos em busca de qualquer sinal de infecção ou desconforto. Forneça alimentos autoclavados no chão da gaiola do microisolador por alguns dias após a cirurgia.
- Remova os grampos cirúrgicos 7 a 10 dias após a cirurgia. Dê gás isoflurano a 3-5% para anestesiar os camundongos. Remova cuidadosamente os grampos e, em seguida, aplique antibióticos e pomadas para aliviar a dor no local.
- Aguarde de 9 a 12 semanas para a reconstituição das células imunológicas humanas e, em seguida, colete sangue periférico da veia safena medial de cada um dos camundongos humanizados.
- Contenha os ratos conscientes usando uma contenção de cone de plástico de tamanho apropriado com uma abertura perto da cabeça do mouse para respirar e uma abertura perto da parte de trás do mouse para isolar uma perna. Coloque os ratos na cabeça do cone de contenção primeiro e, em seguida, puxe suavemente uma perna pela abertura da perna.
- Pulverize o lado medial da perna isolada com isopropanol a 70% e, em seguida, espalhe antibiótico e pomada analgésica no mesmo local.
nota: A pomada ajuda a revelar a localização da veia sem a necessidade de depilação e também auxilia na formação de gotículas de sangue.
- Usando uma agulha de calibre 25 em um ângulo de 90°, perfure a veia e colete 50-100 μL de sangue usando um tubo de coleta de sangue revestido com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Pare o sangramento aplicando pressão no local com gaze estéril. Assim que o sangramento parar, devolva os camundongos à gaiola.
nota: Os volumes máximos de sangue coletados são normalmente de 50 μL por semana ou 100 μL a cada duas semanas.
- Use o sangue periférico coletado para testar o nível de reconstituição de células imunes humanas usando citometria de fluxo com anticorpos para hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19.
3. Tratamento com antibióticos
- Antes do tratamento com antibióticos, colete amostras fecais pré-tratamento. Mova os ratos para uma nova gaiola de microisolador autoclavada.
- Prepare um coquetel fresco de antibióticos de amplo espectro diariamente.
- Prepare 250 mL de água contendo Metronidazol (1 g/L), Neomicina (1 g/L), Vancomicina (0,5 g/L) e Ampicilina (1 g/L) recém-preparados para cada gaiola de microisolador de camundongos.
nota: Use água autoclavada ou estéril para a água potável suplementada com antibióticos.
- Adicione 9,2 g de mistura de bebida adoçada com açúcar de uva a 250 mL de água suplementada com antibióticos.
nota: O uso de mistura de bebida adoçada com açúcar de uva mascara o sabor amargo dos antibióticos e ajuda a prevenir a desidratação nos camundongos.
- Troque a bebida adoçada com antibiótico e açúcar de uva, misture água suplementada e coloque os ratos em uma nova gaiola autoclavada diariamente.
nota: Os camundongos são coprófagos e trocar as gaiolas diariamente evita que os camundongos se reininoculem com bactérias intestinais.
- Para enxerto máximo do microbioma intestinal semelhante ao humano, forneça antibióticos por 14 dias. Durante o tratamento com antibióticos, monitore os camundongos quanto à perda de peso e desidratação. A perda de peso é esperada durante os primeiros 3-4 dias e se estabiliza depois disso durante o tratamento. Se ocorrer desidratação, dê aos camundongos solução salina ou solução de Ringer por injeção intraperitoneal.
nota: Outros protocolos de humanização do microbioma intestinal exigem gavagem oral de antibióticos. Embora eficaz no esgotamento das bactérias intestinais murinas, descobrimos que o método menos invasivo de adicionar antibióticos à água potável colocou menos estresse em nossos camundongos humanizados e levou a melhores resultados.
4. Amostras de doadores e transplante fecal
- Preparar amostras fecais de doadores humanos.
- Use fontes adequadamente preparadas de material de transplante de microbiota fecal (FMT) para transplante fecal em camundongos humanizados.
- Descongelar as preparações de FMT e alíquota em condições anaeróbias numa câmara anaeróbia.
- Se desejar, nesta etapa misture partes iguais das amostras fecais para criar uma amostra "humana" imparcial.
- Mantenha o congelamento e descongelamento do material FMT ao mínimo, se não for necessário aliquotar ou misturar amostras, descongele apenas imediatamente antes do procedimento.
- Transplante fecal humano
- Após a conclusão de 14 dias de tratamento com antibióticos, troque a água potável por água autoclavada e mova os camundongos para uma nova gaiola autoclavada. Pare as trocas diárias de gaiola e implemente um cronograma de troca de gaiola uma vez a cada 1-2 semanas.
- Dê dois transplantes fecais 24 e 48 horas após a interrupção dos antibióticos.
- 24 h após o tratamento com antibióticos, descongelar a quantidade necessária de material FMT e dar a cada ratinho 200 μL de material FMT através de sonda oral. Repita o procedimento novamente 48 h após os antibióticos.
- Espalhe qualquer material FMT descongelado restante ou restante no pelo dos camundongos humanizados ou na cama da gaiola.